酶法制備人乳脂替代品的研究進展

張超越，辛嘉英,2,*，陳林林，王 艷

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

人乳是嬰兒主要和首選的營養來源，是促進嬰兒健康成長的黃金標準[1]。人乳脂肪(human milk fat)能提供嬰兒生長所需膳食能量的40%～55%[2]，供給必需的營養物質，例如甘油三酯中的脂肪酸和長鏈多不飽和脂肪酸，并可作為脂溶性維生素的載體[3-4]，但由于現代生活模式、工作壓力、個人因素等影響[5]，存在母乳不足、母乳營養缺乏、需要增加輔食等情況，嬰兒配方奶粉成為可供選擇的最佳食品之一。而嬰兒配方奶粉中添加的牛乳脂肪在脂肪酸組成及分布上與人乳脂肪差異較大，不能更好地滿足成長中嬰兒的營養需求。因此，近年來對于具有天然油脂的物理特性且脂肪酸組成和結構與人乳脂相似的人乳脂替代品(human milk fat substitutes)的研究備受關注。本文綜述人乳脂中甘油三酯的結構和組成的特異性，指出嬰兒消化吸收的特點和近年來人乳脂替代品的研究進展，以及現階段存在的問題，并對人乳脂替代品的研究前景進行展望。

1 人乳脂中甘油三酯的結構和組成的特異性

人乳脂中的脂肪酸組成與含量隨地域、人種、飲食的不同差別很大，甚至1d內的不同時間，其乳汁中甘油三酯的脂肪酸組成也不一樣[6]。油脂中的脂肪酸因其種類及分布位置不同而具有不同的物理化學性質和營養學意義，尤其是脂肪酸的位置分布決定著脂肪酸和營養物質的吸收代謝[7-8]，并決定了油脂的應用價值，即使含有等量的同種脂肪酸，但由于脂肪酸位置分布的差異，也將導致不同的吸收利用結果。故油脂中的脂肪酸組分固然重要，但脂肪酸的位置分布也不容忽視[9]。

人乳中脂肪含量為4.0%～4.5%，其中98%是甘油三酯。人乳脂與植物油和反芻動物乳相比，具有獨特的結構特征，例如，含有大量長鏈脂肪酸，如棕櫚酸、油酸、亞油酸和硬脂酸；脂肪酸組成中油酸含量最大；60%～70%的棕櫚酸(C16∶0)位于Sn-2位上[10]，而5.7%～8%的硬脂酸(C18∶0)、30%～35%的油酸(C18∶1)和7%～14%的亞油酸(C18∶2)等不飽和酸，則優先在Sn-1,3位上等[11]。

2 乳脂消化吸收的特點

飲食中攝入的脂肪酸、甘油三酯(TAG)在人體內被脂肪酶消化吸收時，胰脂肪酶通常將甘油三酯水解成Sn-1,3位游離脂肪酸和Sn-2位甘油單酯。Sn-1,3位上的不飽和及短鏈游離脂肪酸容易被人體吸收，而飽和脂肪酸則不易被人體吸收[12]。

棕櫚酸是人乳脂肪中主要的脂肪酸組分，并且絕大多數分布在甘油三酯的Sn-2位上，而牛乳和某些嬰兒配方乳中的棕櫚酸主要分布在Sn-1或Sn-3位上，進入機體后被胰脂肪酶水解為游離脂肪酸，易與食物中的鈣離子形成鈣皂排泄出來，造成鈣和能量的流失，人體利用度較差[13]。而Sn-2位的棕櫚酸單甘酯可與膽汁鹽形成乳糜微粒，就會很容易被人體吸收，從而提高人體脂肪酸的吸收率。因此，棕櫚酸在甘油三酯上的位置對嬰兒的營養吸收有著生理學上的重要意義。Sn-2位棕櫚酸可以促進脂肪和鈣的吸收，增加骨骼礦物質，降低脂肪酸皂化和大便硬度，對嬰幼兒的生長發育有促進作用[14]。

3 人乳脂替代品中甘油三酯的來源

目前，嬰兒配方奶粉種類繁多，其中所含的甘油三酯來源主要有4種途徑：1)以植物油直接調和；2)以混合油進行隨機酯交換；3)以牛奶為基本成分再混合植物油加以調配；4)以Sn-2位富含棕櫚酸的油脂或甘一酯與酰基供體通過酯交換來制備[15]。

最初嬰兒配方奶粉中的脂肪主要是全脂奶粉中的牛乳脂肪，但是牛乳脂肪與人乳脂相比，脂肪酸組成和結構存在一定差異。牛乳脂肪中棕櫚酸的含量約為26%[16]，其中Sn-1位上棕櫚酸含量為34%，Sn-2位上棕櫚酸含量為32%；而母乳脂肪中棕櫚酸的含量為20%～25%，其中Sn-2位上棕櫚酸含量約占總棕櫚酸的70%[17]，因此母乳脂肪較以牛乳為原料的嬰幼兒配方食品更容易被嬰幼兒消化吸收。

目前國內多數嬰兒配方奶粉改用植物油(主要是棕櫚油)代替牛乳脂肪來調整脂肪酸的組成和含量，因為牛乳脂肪含有反式脂肪酸，使用植物油可以減少反式脂肪酸，而且其不飽和脂肪酸含量較高。然而，以棕櫚油為主要棕櫚酸來源的嬰兒配方奶粉，甘油三酯經胰脂肪酶水解成游離棕櫚酸，易與金屬離子形成不溶性的鈣皂，從而導致鈣離子和能量的損失[18]。

因此，前3種途徑來源的甘油三酯，其總的脂肪酸組成都可以很好地符合人乳脂肪，但Sn-2位脂肪酸組成很難符合，第4種途徑則能彌補前3種途徑的不足，具有良好的開發前景。

4 酶法制備人乳脂替代品

目前關于人乳脂替代品主要集中于酶法的研究，與傳統的化學催化相比，酶法催化反應條件溫和，有利于保護營養成分不被破壞，最大的優點是酶專一性強、副反應少、產品容易回收。酶法生產人乳脂替代品的主要目標就是通過Sn-1,3位專一性脂肪酶來催化酯交換或者酸解反應，使產物的物理和化學特性均與人乳脂相似，并且這種新的結構脂質能夠應用于類似人乳脂的嬰兒營養食品[19]。用酶法代替化學方法來催化油脂改性，可以有效控制酰基轉移，具有非常高的研究和應用價值[20]。反應底物、酶的種類及添加量、反應體系、水活度、溫度、時間等都將影響酶促酯交換反應速率。通過篩選確定反應的最佳條件，制備出純度高、副產物少的產品。

4.1 反應底物的選擇

酶法酯交換制備人乳脂替代品的底物選擇通常是以Sn-2位富含棕櫚酸的油脂或甘一酯與酰基供體通過酶法酯交換來制備。棕櫚酸主要分布在Sn-2位的原料有棕櫚油硬酯[7]、分提棕櫚油、豬油[6]等；酰基供體主要選擇富含油酸、亞油酸、亞麻酸的植物油或從植物油中提取出混合脂肪酸，按照人乳中脂肪酸的含量來調整各種脂肪酸的比例，將組成合理的酰基供體與底物混合并加入專一性脂肪酶，加入到酶反應器中進行反應[21]。

4.2 脂肪酶的選擇

根據反應底物與母乳甘油三酯結構及脂肪酸含量的異同，酶法酯交換制備人乳脂替代品的脂肪酶應該選用Sn-1,3位專一性脂肪酶。目前，應用較廣泛的是丹麥諾維信生物酶制劑公司生產的Lipozyme TL M、 Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM，此外，Robles等[10]采用脂肪酶DF催化合成富含棕櫚酸和二十二碳六烯酸(DHA)的人乳脂替代品。Sn-1,3位專一性脂肪酶所催化的酯交換反應分兩步完成，即水解反應和酯化反應。在脂肪酶的催化下，首先形成中間體甘油二酯(DAG)，并有一小部分水解為甘油一酯( MAG)，DAG再與反應體系中的新脂肪酸酯化從而形成新的甘油三酯。

酶的添加量對酯交換反應效率有一定影響，隨著酶添加量增加，反應程度逐漸提高，但酶添加量繼續增加，反應會趨于平衡，脂肪酸插入率不再升高，并且酶量增加對酰基轉移有促進作用，產生副產物[22]，所以，應在保證一定反應速度的同時，盡可能減少酶用量，不僅可以減少酰基轉移的程度和副產物含量，還可以降低生產成本，綜合考慮酶的最適用量為5%～10%之間。

脂肪酶的反應溫度一般控制在60℃左右，溫度過高或過低都會使酶活力下降，反應緩慢，且反應時間不能過長，當反應體系中的甘油三酯被水解60%時，Sn-2位的酰基尚未向Sn-1,3位發生轉移，此時需加入乙醇終止反應，對水解產物分離后進行檢測。酶只有在一定水分活度條件下才有催化活性，但水活度過高會促進酯水解反應發生而導致副產物形成。因此在酯交換反應中控制水分是十分必要的。在最佳的水活度條件下，酶具有最高的催化活性和選擇性。可以采用分子篩、含結晶水化合物、水飽和鹽溶液等對水活度進行控制，采用減壓干燥等對反應進行即時水活度控制。

4.3 反應體系的建立

脂肪酶催化油脂改性的反應體系主要分為有機溶劑體系、微水條件下的無溶劑體系、微乳液體系和超臨界流體。

有機溶劑體系進行酶促反應有許多優勢，但是溶劑的使用會造成一定的環境污染，而且大多數溶劑都存在不同程度的毒性，如果溶劑殘留則不能食用。無溶劑體系提供了與傳統溶劑不同的新環境，是目前較常用的反應體系。酶直接作用于反應底物，反應速度快、產物純化容易，降低了對環境的污染和回收有機溶劑的成本，但是反應混合物黏度大，往往需要較高的溫度。

超臨界CO2具有溶解甘油三酯和脂肪酸、保持脂肪酶的活性、不參與化學反應、在適當的情況下易于與產物和底物分離、反應溫和且有益于熱敏性和易氧化物質的穩定性提高等優點，目前有關超臨界CO2介質中的酶促改性油脂反應也有相關研究報道[23]。

4.4 脂肪酸分布位置的檢測方法

在評價一種油脂的營養價值時，除考慮其脂肪酸組成外，還應考慮甘油三酯中脂肪酸分布位置，即使脂肪酸組成和含量相同，若脂肪酸的分布位置間存在差異，也會導致油脂在機體內的吸收和利用產生差異進而影響其營養價值。常用的甘油三酯中脂肪酸分布位置檢測方法是氣相色譜法和液相色譜法。

氣相色譜法首先采用薄層層析法(TLC)將甘油三酯進行分離純化，然后進行甲酯化處理，使一些較難氣化的脂肪酸變成可氣相檢測的脂肪酸甲酯，進而進行氣相分析。由于這種甲酯化方法反應時間較長并且反應不夠完全，有些學者研究了一步法測定乳制品中的脂肪酸組成，利用乙酰氯與甲醇反應得到的鹽酸-甲醇使試樣中的脂肪和游離脂肪酸甲酯化，處理方法快速，適合于批量樣品的測定[24]。

為了克服氣相色譜法流程操作復雜、耗時耗力的缺點，趙海珍等[23]研究開發了一種采用液相色譜法檢測甘油三酯中脂肪酸分布位置的方法。首先采用Sn-1,3位專一性脂肪酶對油脂進行水解，生成游離脂肪酸和Sn-2位甘油單酯，然后向水解產物中加入2-溴苯乙酮，利用其只與游離脂肪酸反應的特性，與水解體系中的游離脂肪酸生成苯甲酰甲基酯，然后利用液相色譜對生成的各類苯甲酰甲基酯進行檢測，進而得知待測豬油甘油三酯中Sn-1,3位的脂肪種類。將總的甘油三酯中脂肪酸的種類和數量減去Sn-1,3位脂肪酸的種類和數量，即可知道Sn-2位脂肪酸的種類及數量。

4.5 酶促合成人乳脂替代品方法

4.5.1 酶促酸解法

酶促酸解法是甘三酯(TAG)在脂肪酶的催化下與脂肪酸之間發生酰基轉移從而改變TAG結構組成的方法[25]。該方法制備人乳脂替代品一般采用Sn-2上富含棕櫚酸的TAG以及游離的多不飽和脂肪酸(PUFA)，在Sn-1,3位專一性脂肪酶的作用下進行酶法酸解，將PUFA結合到TAG的Sn-1,3位上，進而研究人乳脂替代品的物理特性以及最佳反應條件。利用酶促酸解法對油脂進行改性，專一性強，有位置和立體選擇性等優點，也可避免高溫對油脂的破壞。近年來，酶促酸解法生產結構脂質在油脂工業中的應用越來越廣泛，但酶法生產價格較高，僅局限于某些特殊領域，如嬰兒配方奶粉、制藥等，另外，酶生物反應器也是工業化生產的限制因素，相信隨著研究的不斷深入以及成本的降低，其應用會越來越廣泛。

Yüksel等[2]合成的富含亞麻酸的人乳脂替代品是由三棕櫚酸甘油酯與游離脂肪酸通過酶法酸解反應產生的，其中游離脂肪酸是從榛子油和一些商品油混合物中獲得的，用于催化反應的是Sn-1,3位專一性脂肪酶Lipozyme TL IM。采用響應曲面法獲得最佳反應條件是反應溫度60℃、反應時間8h、底物物質的量比為4∶1，此條件下的亞麻酸和油酸含量分別增加至2.0、22.9mol/100mol總脂肪酸，Sn-2位上棕櫚酸為46.2mol/100mol總脂肪酸，并且，所得的人乳脂替代品的抗氧化性有所提高，與三棕櫚酸甘油酯相比有更寬的熔點范圍。Nagachinta等[3]酸解棕櫚油和從二十二碳六烯酸單細胞油(DHASCO)和花生四烯酸單細胞油(ARASCO)中提取的游離脂肪酸混合物，在正己烷體系中用Novozym 435做催化劑，采用響應曲面法進行優化，最終確定最佳反應條件為底物物質的量比為18∶1、反應溫度60℃、反應時間24h，這個條件下獲得每100g產物含有25.25g DHA和ARA，Sn-2位上含有17.20g DHA和ARA。這種結構脂質的脂肪酸組成與人乳脂肪相似，可為孕婦提供營養需求。Yang Tiankui等[6]在無溶劑體系中，通過Lipozyme RM IM進行豬油與大豆油脂肪酸的酸解反應，最佳條件為反應溫度61℃、反應時間1h、豬油和脂肪酸的物質的量比為1∶2.4、酶添加量13.7%、含水量3.5%，所得產物的特性與中國女性的乳脂相似。Robles等[10]通過四步合成結構甘油三酯，使它在Sn-2位上富含DHA和棕櫚酸，Sn-1,3位上富含油酸。首先用非位置專一性的脂肪酶Novozym 435進行催化金槍魚油和商品棕櫚酸酸解，獲得富含棕櫚酸和DHA的甘油三酯，然后用KOH-乙醇法進行純化，接著用Sn-1,3位專一性脂肪酶DF酸解富含油酸的游離脂肪酸和所得到的甘油三酯，純化后獲得了Sn-1,3位含67mol油酸、Sn-2位含52.1mol棕櫚酸，15.4molDHA的甘油三酯，并且沒有檢測到游離脂肪酸的殘留。Tecel?o等[26]通過酶催化酸解反應制備人乳脂替代品，分別研究了無溶劑體系條件下，三棕櫚酸甘油酯與油酸(體系1)和ω-3多不飽和脂肪酸(體系2)在60℃時，4種固定化脂肪酶C.parapsilosislipase/acyltransferase、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435在批式操作條件下的酶活性及穩定性。最終得出酶的活性及穩定性取決于使用的酰基供體。Jiménez等[27]在無溶劑體系條件下通過酸解棕櫚酸硬酯(含60%棕櫚酸、Sn-2位含23%棕櫚酸)與富含棕櫚酸的游離脂肪酸混合物，生產Sn-2位富含棕櫚酸的甘油三酯，以脂肪酶QLC(固定化于硅藻土)催化反應，最佳操作條件為：反應溫度65℃、游離脂肪酸和棕櫚酸硬酯的物質的量比為3∶1，最終得到Sn-2位上含80%棕櫚酸的甘油三酯。Esteban等[28]通過酶法酸解富含棕櫚酸的甘油三酯和富含油酸的游離脂肪酸，合成結構為油酸-棕櫚酸-油酸(OPO)的高純度甘油三酯，作為人乳脂替代品。分別研究了有無正己烷添加時的最佳反應條件。在正己烷體系中，脂肪酶DF催化反應，溫度37℃、游離脂肪酸和甘油三酯的物質的量比為6∶1、反應時間1h，該條件下獲得了Sn-1,3位含67.2%的油酸、Sn-2位含67.8%的棕櫚酸。在無溶劑體系中，溫度50℃、游離脂肪酸和甘油三酯的物質的量比為6∶1、反應時間19h，該條件獲得的Sn-1,3位含67.5%的油酸、Sn-2位含57%的棕櫚酸。Li Yanqi等[29]用lipozyme RM IM酶法酸解牛乳脂與油菜籽油、大豆油混合物，制備人乳脂替代品。并設計了2周飼養小鼠實驗，結果表明，合成的人乳脂替代品大大減少了喂養后的小鼠體內鈣皂的形成，脂肪與鈣的吸收率明顯提高。

4.5.2 酶促轉酯法

酶促轉酯法是指在脂肪酶催化下，兩種不同組成的TAG或TAG與簡單酰基酯之間發生反應，酯類分子間的酰基發生交換而得到目的脂質的方法[23]。該方法制備人乳脂替代品一般選用植物油混合物或者植物油與動物油混合作為反應底物，調整合適的底物物質的量比，進行酶促轉酯反應，近年來，采用該法制備人乳脂替代品與酶促酸解法相比，研究率較低，可能是由于產物TAG中脂肪酸含量可以符合人乳脂肪，但脂肪酸位置并不能很好地符合人乳脂的天然結構，從而會影響嬰兒對乳脂的吸收。

Silva等[19]通過Sn-1,3位專一性脂肪酶Lipozyme TL IM，將豬油與大豆油混合物酶法轉酯，并描述了產物結構脂質的物理特性和化學組成，轉酯反應混合物的固體脂含量、稠度、結晶區域、軟化溫度等值均減小，使其類似于人乳脂，滿足兒童的營養需求。Karabulut等[30]將棕櫚油、棕櫚仁油、橄欖油、葵花油和深海油脂混合物按質量比為4.0∶3.5∶1.0∶1.5∶0.2混合，通過Lipozyme TL IM酶法轉酯，合成與人乳脂結構相似的人乳脂替代品。在配有磁力攪拌的雙夾套玻璃反應器內進行反應，在60℃、24h時，產物的總脂肪酸和Sn-1,3位脂肪酸組成與人乳脂相似，但是Sn-2位上棕櫚酸含量較人乳脂低，可以通過Sn-2位富含棕櫚酸的油脂作為底物進行反應來彌補不足。Maduko等[31]將3種混合植物油添加到脫脂羊奶中，將羊奶中的脂肪酸和固醇改性，使其應用于嬰兒配方奶粉中，得出椰子油、紅花油、大豆油的體積比為2.5∶1.1∶0.8時，脂肪酸組成以及膽固醇和植物甾醇含量更接近人乳脂。

5 結 語

目前，國外酶法合成人乳脂替代品已逐步從實驗室研究階段轉向工業化生產和應用階段，例如Lipid Nutrition公司的商業化產品BetapolTM，已經被中國衛生部于2008年7月正式批準可作為嬰幼兒配方食品添加劑[21]，而國內當前脂肪酶用于油脂改性研究才剛剛起步。這其中的主要原因可以歸納為目前的脂肪酶產量和種類有限，價格較貴，后續純化問題復雜，另外一些工業技術尚未完全成熟；乳制品的“天然性”問題也成為乳脂生物催化結構化在食品應用中的另一個限制。今后努力的方向一方面是保持投入工業化生產，并且使消費者可以接受酶解產品，另一方面，著重于連續反應的應用，提高催化效率，并且全面評估乳結構脂質的物理性質、營養和氧化穩定性等方面[32]。從脂肪酶的可利用數量和特性來看，酶解方法的進展是快速的，因而酶技術開發母乳脂肪的替代物成為發展趨勢且具有良好的開發前景。

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