光譜法研究硒代大蒜新素與大蒜新素對DPPH自由基的清除作用

周美云，李毅群，陳填烽，鄭文杰*

(暨南大學化學系，廣東 廣州 510632)

大蒜是人體循環及神經系統的天然強健劑[1-5]。數千年來在中國、埃及、印度等國，大蒜既作為食物又作為傳統藥物而廣泛應用。在美國，大蒜新素制劑已排在人參、銀杏等保健藥物中的首位，它的保健功能可謂婦孺皆知。一般認為，大蒜的營養保健作用與所含硫化合物的抗氧化作用密切相關[6-9]。

富硒大蒜是指含硒量較高的大蒜[10-12]，其具有比普通大蒜更強的生物活性，可強化大蒜抑制人體白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、口腔癌的作用[13-15]。其原因自然與硒元素有關。硒與硫同屬一主族，其能夠取代硫直接插入蒜氨酸的代謝途徑，生成硒代蒜氨酸，進一步產生各類含硒化合物[11]，硒代大蒜新素是富硒大蒜中含量最高的含硒化合物，與大蒜新素互為同系物(用硒取代了大蒜新素中的硫元素)，結構相似。硒代大蒜新素在大蒜中的含量，是區別普通大蒜與富硒大蒜的主要指標，通過對硒代大蒜新素與大蒜新素的生物活性比較，可以為普通大蒜與富硒大蒜在生物活性上的差異提供有力的解釋。遺憾的是，即使是富硒大蒜中含量最大的含硒化合物——硒代大蒜新素[16-18]，其含量依然很低，無法純化得到單體化合物，所以人們尚未準確認識到該類化合物在生物活性中所扮演的關鍵角色。本實驗采用化學合成法，合成了大蒜新素與硒代大蒜新素，用比色法測定其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力、動力學特性以及IC50，并比較兩者在抗氧化活性方面的差異，初步揭示富硒大蒜中硒代大蒜新素的抗氧化功能，為富硒大蒜具有比普通大蒜更好的抗氧化活性提供了新的解釋，亦為富硒大蒜的推廣提供了新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

硒粉、硼氫化鈉、溴丙烯、高純硫、硫化鈉 阿拉丁試劑(上海)有限公司。

UV3600紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；電子天平Acculab ALC210 德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 大蒜新素與硒代大蒜新素的合成

1.2.1.1 合成大蒜新素

首先按文獻[19]方法合成二硫化鈉，然后在攪拌條件下小心緩慢滴入化學計量的溴丙烯，滴加完畢后加熱回流3h。而后用石油醚萃取，用硅膠柱純化得到大蒜新素樣品，結構如圖1所示。

圖1 大蒜新素(a)與硒代大蒜新素(b)的化學結構Fig.1 Chemical structures of allicin (a) and Se-allicin (b)

1.2.1.2 硒代大蒜新素的合成[20]

取4g(0.1mol)氫氧化鈉固體溶于50mL水中，然后加入7.9g(0.1mol)硒粉和0.001g四乙基溴化銨。另取0.5g(0.0132mol)硼氫化鈉固體和0.4g(0.01mol)氫氧化鈉固體，并于冰水浴中加入10mL水溶解，而后于氮氣保護和強烈攪拌下將硼氫化鈉堿液滴入上述的硒溶液中，室溫條件下反應1h后，升溫至90℃反應30min，得到具有特征棕紅色0.05mol的堿性二硒化鈉水溶液。將制得的上述溶液與烯丙基溴攪拌3h，生成黃色溶液，過濾分離，即得硒代大蒜新素。

1.2.2 DPPH自由基清除實驗

取無水乙醇配制成的5×10-5mol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基溶液2mL加入10mL比色管中，再加入一定量抗氧化劑溶液，無水乙醇補充體積至10mL刻度，充分混勻30min后在520nm左右波長處檢測其吸光度，并按下式計算其清除率。

式中：A0為無抗氧化劑空白的吸光度；AS為加抗氧化劑時吸光度。

1.2.3 半數抑制率(IC50)的計算

以樣品的濃度對自由基清除率作圖并進行線性擬合，并計算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度。

2 結果與分析

2.1 DPPH反應體系的吸收光譜及測定波長的確定

DPPH自由基其醇溶液呈紫色，當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數量成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析。本研究對DPPH自由基、大蒜新素及硒代大蒜新素的乙醇溶液進行UV-Vis光譜掃描，結果如圖2所示。DPPH溶液在517nm波長處出現特征吸收峰，而大蒜新素以及硒代大蒜新素在450nm波長以上范圍沒有吸收峰，說明這兩種物質本身不會對反應測定造成干擾。

圖2 DPPH溶液、大蒜新素、硒代大蒜新素的UV-Vis光譜吸收曲線Fig.2 Absorption spectra of DPPH, Se-allicin and allicin

圖3 添加硒代大蒜新素(a)與大蒜新素(b)后DPPH溶液UV-Vis光譜吸收曲線的變化Fig.3 Effect of the presence of Se-allicin (a) or allicin (b) on absorption spectrum of DPPH

由圖3可知，加入上述兩物質后，DPPH溶液在517nm波長處的吸收峰呈劑量效應，具有較好的線性關系，因此本實驗選擇517nm波長作為DPPH自由基清除實驗的檢測波長。

2.2 DPPH體系的反應動力學

在DPPH自由基清除實驗中，體系反應穩定時間是關鍵影響因素。為了解所采用的DPPH體系的反應動力學特性，研究DPPH溶液在加入大蒜新素和硒代大蒜新素后吸光度隨時間變化的規律，如圖4所示，在5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中分別加入硒代大蒜新素(終濃度分別為4.6、12μmol/mL)和大蒜新素(終濃度為180、370μmol/mL)樣品后，體系的特征吸收峰A517nm在4min內顯著下降，在4min后，體系基本趨于平衡，至30min時，A517nm達到完全穩定狀態，說明對于不同的抗氧化劑，30min是合適、穩定的反應時間點，可進一步用于劑量效應研究。

圖4 添加硒代大蒜新素(a)與大蒜新素(b)后DPPH溶液在517nm波長處的吸光度隨時間的變化規律Fig.4 Changes over time in absorbance at 517 nm of DPPH with added Se-allicin (a) or allicin (b)

2.3 抗氧化劑清除DPPH自由基的劑量效應及其對比評價

圖5 硒代大蒜新素(a)與大蒜新素(b)對DPPH自由基抑制作用的劑量與線性關系Fig.5 Linear dose-dependent DPPH free radical scavenging activity of Se-allicin (a) and allicin (b)

根據以上選定的測定波長和反應時間，測定一系列濃度(倍比稀釋)的大蒜新素和硒代大蒜新素對DPPH自由基的清除率，計算相應抗氧化劑的IC50值，并對其抗氧化活性進行對比評價。由圖5可知，對于DPPH反應體系，硒代大蒜新素和大蒜新素分別在2.5～30μmol/mL和180～500μmol/mL的濃度范圍內對自由基清除率有良好的線性關系，據此可計算硒代大蒜新素、大蒜新素的IC50值分別為15.3、387μmol/mL。結果提示，富硒大蒜中硒元素插入蒜氨酸的代謝途徑后，產生的含硒化合物比對應的含硫化合物的抗氧化活性大幅增加，這在一定程度上說明了富硒大蒜具有更高生物活性和營養價值的原因，也預示著富硒大蒜具備良好的市場前景和開發潛力。

3 結 論

通過化學合成手段，制備了大蒜中最具代表性的含硫化合物——大蒜新素，以及富硒大蒜中的特征化合物——硒代大蒜新素，研究并比較了兩者清除DPPH自由基的能力及其光譜學特征。結果表明：采用分光光度法測定兩者清除DPPH自由基能力，確定其測定波長為517nm，穩定時間為30min。在優化的反應體系中，硒代大蒜新素與大蒜新素對DPPH自由基的半數抑制濃度(IC50)分別為15.3、385μmol/mL，硒代大蒜新素的抗氧化活性明顯強于大蒜新素，為富硒大蒜比普通大蒜具有更強的生物活性這一實驗現象的解釋提供了一定的依據，預示著富硒大蒜具備良好的市場前景和開發潛力。

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