灰葉馬尾藻多糖的提取及其生物活性

劉 芳，鄭育聲，尹學瓊,*，沈 琦，楊冬云

(1.海南大學 海南省精細化工工程研究中心，海南 海口 570228；2.海南惠普森醫藥生物技術有限公司，海南 海口 570216)

多糖是由同種單糖或不同種單糖通過糖苷鍵結合而成的天然大分子碳水化合物，普遍存在于高等植物、細菌、真菌、藻類和動物體內，自然資源豐富。天然多糖不僅對正常細胞無毒副作用，而且具有提高免疫、抗病毒、抗輻射、抗癌、降血糖、減肥和抗氧化等作用[1-5]。海洋中的海藻、蝦蟹殼、微生物等蘊含著極其豐富的甲殼素、硫酸多糖、肝素等活性多糖，是開發海洋生物多糖保健食品和多糖藥物、尋找新型多糖藥物先導化合物的寶貴資源[6-8]。

灰葉馬尾藻(Sargassum cinereum)，隸屬褐藻門、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬，主要分布于我國東海、南海沿岸[9]，由于其可食性差，目前開發利用度較低，對其有效成分研究較少。本研究采用NaOH水溶液對海南產灰葉馬尾藻進行多糖提取純化、結構分析及生物活性測定，以期為開發海南特色海藻資源提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰葉馬尾藻采自海南省南燕灣，經海南大學農學院劉美華副教授鑒定，確定為灰葉馬尾藻。海藻經洗凈曬干后，剪成0.5cm碎片裝入塑料袋備用。抗癌活性測定中所用細胞為人前髓性白血病細胞(HL60)。

CCK8細胞計數試劑盒 日本Dojindo公司；NaOH、無水乙醇、NaCl、硫酸、鹽酸、氯仿、正丁醇中國醫藥上海化學試劑公司；DEAE-32纖維素 北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠SephadexG-75 美國Pharmacia公司；瓊脂糖、溴酚藍、硫酸亞鐵、5,5-二甲基-吡咯啉-N-氧化物(DMPO) 阿拉丁試劑(中國)有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FD-1E冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司；T6新銳可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；KQ3200B超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Paragon 1000傅里葉紅外光譜儀 美國PE公司；1515GPC凝膠滲透色譜 美國Waters公司；A320電子自旋共振儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取與純化

稱取2g灰葉馬尾藻碎片，加入80mL NaOH水溶液(質量濃度分別為1、2、3g/100mL)，80℃超聲1h，再在80℃恒溫水浴4h，抽濾，取上清液濃縮。用2% HCl調pH值至4，4℃靜置過夜。離心，沉淀用20mL超純水溶解，轉入分液漏斗中，加入20.0mL Sevag去蛋白質試劑(氯仿、正丁醇體積比為4∶1的混合液)，劇烈振搖15min，靜置30min，棄去有機溶劑層和蛋白質層，再加入20.0mL Sevag試劑。重復以上操作，直至其水溶液用紫外光譜儀檢測不到蛋白質為止。在去蛋白后的溶液中加入50mL無水乙醇，4℃靜置過夜。離心，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得產品[10]。

取0.3g灰葉馬尾藻多糖樣品溶于20mL水中，注入DEAE-32纖維素離子交換柱(2.6cm×60cm)，分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L NaCl溶液洗脫，洗脫體積流量為2mL/min，每管收集4mL，以苯酚-硫酸法檢測多糖含量，收集、濃縮、透析，冷凍干燥，得純多糖[11]。

1.3.2 結構分析

將各待測樣品及0.1%溴酚藍指示劑于瓊脂糖電泳(厚度約為3mm，7cm×9cm)負極端點樣，點樣量為5μL，置于電泳槽中；加入電極緩沖液，于電壓10V/cm進行電泳。觀察指示劑移動情況，待指示劑行至距凝膠前沿約1.5～2cm處，停止電泳。剝取凝膠，置甲苯胺藍染色液染色10min，用水脫色[12]。

將多糖溶解在水中，以凝膠滲透色譜測試分子質量分布情況，測試條件如下：檢測器：示差檢測器；流動相：0.05%疊氮化鈉水溶液；流速：0.6mL/min；柱溫：55℃；檢測器溫度：50℃；柱子填料：葡聚糖；柱子型號：UtrahydrogelTM500、UtrahydrogelTM120雙柱串聯。以葡聚糖系列多糖標定色譜柱[13]。

分別取各濃度淋洗得到的精多糖樣品少量，KBr壓片，在4000～400cm-1波數處，用Paragon 1000傅里葉紅外光譜儀進行掃描。

1.3.3 抗羥自由基(·OH)活性測試

將50μL 1%多糖樣品或者作為對照的等體積的雙蒸水，50μL 0.05mol/L的PBS溶液(pH7.4)加入到50μL 0.3mol/L DMPO溶液和10mmol/L FeSO4溶液，再加入50μL 10mmol/L H2O2溶液啟動反應，將反應體系吸入密封的毛細管中。2.5min后用ESR光譜儀記錄ESR圖譜。測試條件為：中心磁場(CF)：3512.3G；掃描寬度(SW)：200G；掃描時間(ST)：15.36s；調制幅度(MA)：3.0G；調制頻率：100kHz；微波頻率：9.863GHz；微波功率：20.0mW；測試溫度：室溫[14]。

多糖溶液對·OH的清除作用以清除率表示，計算公式為：

式中：H0和HX分別為樣品不添加和添加多糖時ESR圖譜第2峰信號強度(高度)。

1.3.4 抗癌活性測定[15]

藥物溶解：用滅菌PBS溶解SP1和SP2，總質量濃度為50μg/μL，稀釋至10μg/μL，備用。

細胞接板：設置0、24、48、72h 4個檢測時間。在96孔板中每孔接種10×104個HL60細胞，之后，在每孔中分別加入9μL以上2種藥物，使其終質量濃度達到900μg/μL，放置培養箱中培養至各設定檢測時間。

細胞生長情況檢測：96孔板測定孔中加入10μL CCK-8，分別于450nm和600nm(參比波長)處測定光密度(OD)值，樣品OD值為OD450nm－OD600nm。

2 結果與分析

2.1 灰葉馬尾藻多糖的產率

采用NaOH水溶液提取灰葉馬尾藻多糖，通過Sevag法脫蛋白、DEAE-纖維素柱層析進行多糖純化。以0.2、0.4、0.6、0.8mol/L NaCl淋洗DEAE-纖維素柱，0.2mol/L NaCl溶液洗脫得樣品SP1，產量為總上樣量的46.2%；0.4mol/L NaCl溶液洗脫得樣品SP2，產量為總上樣量的41.1%；其他濃度的NaCl溶液洗脫得到的樣品量太少，無法收集分析。

當提取溫度80℃、提取時間4h、NaOH的質量濃度為1、2、3g/100mL時，脫蛋白未過柱的粗多糖的產率分別為9.6%、13.4%、11.0%。

2.2 灰葉馬尾藻多糖的理化性質

經冷凍干燥后的SP1、SP2均呈淺黃色海綿狀，易溶于熱水，不溶于無水乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑。SP1、SP2的水溶液均為透明的黏稠狀淺黃色液體，苯酚-硫酸顯色反應陽性。對SP1、SP2水溶液進行紫外光譜掃描，沒有發現在260、280nm波長處的核酸和蛋白質特征吸收峰，說明提取的多糖基本不含多肽和蛋白質[11]。

2.3 瓊脂糖電泳結果

圖1 灰葉馬尾藻粗多糖的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of SP1 and SP2

采用瓊脂糖電泳法對所得的多糖純度及荷電性進行檢驗，如圖1所示。SP1、SP2都帶負電荷，圖中SP1、SP2均為單一均勻連續帶，表明SP1、SP2所帶電荷數相近，且SP1譜帶比SP2寬，即SP1分子質量分布較寬。

2.4 凝膠滲透色譜(GPC)結果

圖2 多糖分子質量分布GPC圖Fig.2 GPC curves of SP1 and SP2

多糖分子質量及化學結構對其性能具有重要影響作用[16-17]，本實驗采用GPC對SP1、SP2分子質量進行測量。由圖2可知，SP1、SP2均為較單一峰，但是SP1分子質量分布很寬，而SP2分子質量分布較窄。由表1可知，SP1數均分子質量約36kD，分子質量分散系數為1.79；SP2數均分子質量約為77kD，分子質量分散系數為1.29。GPC分析結果與電泳結果一致。

表1 灰葉馬尾藻多糖分子質量分布情況Table 1 Molecular weight distribution of SP1 and SP2

2.5 紅外光譜分析結果

為了證實SP1、SP2中有羧基存在，對由NaOH溶液提取所得SP1、SP2(稱為堿式糖)進行酸化處理，將SP1與SP2溶解后，加稀鹽酸調節pH值到4，再用分子質量3500D的透析袋透析，冷凍干燥得SP1a與SP2a (稱為酸式糖)。由圖3～4可知，SP1、SP2具有相似的紅外譜圖，在3400～3450cm-1間處出現一寬峰，為O—H的伸縮振動，表明多糖存在分子間和分子內氫鍵；2920～2935cm-1處的吸收峰較弱，為C—H伸縮振動[18]；1250.7cm-1處出現硫酸基(—O-SO)中S—O的伸縮振動峰，表明樣品為硫酸多糖。在SP1a、SP2a的圖譜上，1615cm-1為—C=O(—COONa)對稱伸縮振動峰，酸化后該峰明顯減弱，在1737.0cm-1處出現新的吸收峰，表明—COONa轉化成了—COOH。1035～1045cm-1處為吡喃環結構的C—O吸收峰，該吸收峰的存在說明樣品主要為吡喃多糖，805～820cm-1是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰[18]。

圖3 SP1的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of SP1

圖4 SP2的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of SP2

2.6 抗氧化活性

圖5 灰葉馬尾藻多糖清除?OH活性Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging capacity of SP1 and SP2

由圖5可知，10mg/mL的SP1和SP2都有非常明顯的清除?OH活性，其中SP1清除率為87.2%，SP2清除率為61.5%(具體計算數據未顯示)；降低多糖質量濃度至1mg/mL，SP1和SP2對?OH清除活性變化，SP1清除率為18.8%，SP2清除率為67.1%(具體計算數據未顯示)。通過對比可以看出，SP1由10mg/mL稀釋到1mg/mL后，對?OH的清除作用明顯減弱，而SP2由10mg/mL稀釋到1mg/mL后，對?OH的清除活性反略有升高。SO42－和糖醛酸的含量對?OH的清除作用影響明顯，低硫高糖醛酸組分對?OH的清除活性更好一些[19]。有些多糖對?OH的清除能力，是在一定范圍內隨著質量濃度的升高而增強，但超過某一質量濃度后，對?OH的清除能力隨質量濃度的升高反而降低[20]。

2.7 抗癌活性測定結果

圖6 SPI和SP2對HL60細胞生長的影響Fig.6 Effects of SP1 and SP2 on the growth of HL60 cells

由圖6可知，從接種到72h培養過程中，空白組OD值不斷升高，說明HL60細胞正常生長，累計數量逐漸增多。而添加SP1和SP2的2個實驗組，其OD值增加不大，表明SP1和SP2均具有較強的抑制HL60細胞生長的作用，SP2抑制活性更高。SP1和SP2發揮抑制白血病細胞作用的時間約在接觸細胞24h后，在48h時抑制作用最為明顯。

3 結 論

采用NaOH水溶液對灰葉馬尾藻進行超聲浸提，柱層析得到2種純度較高的水溶性灰葉馬尾藻多糖SP1、SP2，對所得多糖進行初步結構分析，并測定SP1、SP2的抗氧化和抗癌活性。體外抗氧化測定表明，SP1和SP2均具有良好抗氧化活性，且隨質量濃度降低，SP1對?OH的清除率下降，SP2的清除率反而升高，該反應的機理有待進一步研究。體外抗癌測試結果揭示SP1和SP2均具有較強的抑制白血病細胞生長活性，其作用機制也有待深入探討。灰葉馬尾藻多糖含量高、提取工藝簡單、生物活性高，在開發海洋多糖類藥物方面具有良好應用前景和開發價值。

[1]MARGUERITE R.Main properties and current applications of some polysaccharides as biomaterials[J].Polym Int, 2008, 57∶ 397-430.

[2]張昕, 張強, 梁彥龍.香菇多糖的抗腫瘤和降糖作用機制的研究進展[J].中國藥事, 2008, 22(2)∶ 149-154.

[3]VARENNE A, GAREIL P, COLLIEC-JOUAULT S, et al.Capillary electrophoresis determination of the binding affinity of bioactive sulfated polysaccharides to proteins study of the binding properties of fucoidan to antithrombin[J].Anal Biochem, 2003, 315(2)∶ 152-159.

[4]MUZZARELLI R.Biochemical significance of exogeneous chitins and chitosans in animals and patients[J].Carbohydr Polym, 1993, 20∶7-16.

[5]LIU J, PEDERSEN L.Anticoagulant heparan sulfate∶ structural specificity and biosynthesis[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74∶263-272.

[6]徐靜, 謝蓉桃, 林強, 等.海洋生物多糖的種類及其生物活性[J].中國熱帶醫學, 2006, 6(7)∶ 1277-1278.

[7]CARLUCCI M J, CIANCIA M, MATULEWICZ M C, et al.Antiherpetic activity and mode of action of natural carrageenans of diverse structural types[J].Antiviral Res, 1999, 43∶ 93-102.

[8]王文濤, 周金黃, 邢善田, 等.海藻硫酸多糖對正常及免疫低下小鼠的免疫調節作用[J].中國藥理學與病理學雜志, 1994, 8(3)∶ 199-202.

[9]曾呈奎.中國常見海藻志[M].北京∶ 科學出版社, 1983∶ 212-213.

[10]劉承穎, 王維民.半葉馬尾藻中巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝研究[J].食品科技, 2008, 11(5)∶ 194-197.

[11]孟慶勇, 劉志輝, 徐美奕, 等.半葉馬尾藻多糖的提取和分析[J].光譜學與光譜分析, 2004, 12(12)∶ 1560-1562.

[12]周靜華, 萬順康, 張翠香.大理百合多糖的提取、純化及性質研究[J].現代預防醫學, 2011, 38(10)∶ 1910-1914.

[13]侯軒, 周家容, 田允波.白術多糖的提取、分離純化及分子量的測定[J].仲愷農業工程學院學報, 2009, 22(2)∶ 18-21.

[14]劉騫, 孔保華, 夏秀芳, 等.應用電子自旋共振(ESR)法測定豬血漿蛋白水解物抗氧化活性的研究[J].食品科學, 2009, 30(3)∶ 74-80.

[15]張華芳, 金京順.羊棲菜多糖誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究[J].時珍國醫國藥, 2006, 17(7)∶ 1124- 1125.

[16]張悅, 宋曉玲, 黃倢.微生物多糖結構與免疫活性的關系[J].動物醫學進展, 2005, 26(8)∶ 10-12.

[17]林夢感, 楊義芳, 李永輝.多糖抗腫瘤活性構效關系的研究進展[J].中草藥, 2007, 38(6)∶ 949-953.

[18]孟慶勇, 劉志輝, 徐美奕, 等.半葉馬尾藻多糖的提取和分析[J].光譜學與光譜分析, 2004, 24(12)∶ 1560-1562.

[19]趙雪, 董詩竹, 孫麗萍, 等.海帶多糖清除氧自由基的活性及機理[J].水產學報, 2011, 35(4)∶ 531-537.

[20]倪慧, 卿德剛, 凱撒·蘇萊曼, 等.EPR技術研究枸杞多糖清除·OH自由基作用[J].中藥材, 2004, 27(8)∶ 599-600.