青藤堿-γ-環糊精包合物的性質及譜學分析

陳迪釗，朱士龍，李 勇，林紅衛，段友構

(1.懷化學院化學化工系，湖南 懷化 418008；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418008；3.吉首大學化學化工學院，湖南 吉首 416000)

青藤堿(sinomenine，SN)是從青風藤(Caulis sinomenii)中提取的一種有效成分，具有抗炎、免疫抑制、鎮痛、抗心律失常等多種生物活性[1-4]。青藤堿在水溶液中溶解度較低，且對堿、光、熱不穩定，易分解，故在醫藥、食品及保健品工業上常用其鹽酸鹽[5-6]。由于人體皮膚、口腔、胃黏膜等對酸、堿度較敏感，現有青藤堿的成品和制劑因其酸性過大，對人體產生較強的刺激作用，導致其在醫藥、保健品等使用中受到一定的限制。

環糊精(cyclodextrin，CD)是淀粉降解的環狀低聚化合物，具有特殊的空腔結構[7]。CD可以和不同系列的客體分子發生包合作用，提高客體分子的溶解性和穩定性[8-9]。CD的這種獨特的性質被廣泛應用于食品、化妝品和制藥工業中[10-12]。從目前CD的研究情況看，β-CD的應用最為常見[13-14]，但由于β-CD本身的水溶性小、組織刺激性大等缺點限制了其更廣泛的應用，γ-CD的空腔直徑和空腔體積要大于β-CD，且具有水溶性好、局部刺激小且毒性最小等優點[15]。青藤堿與γ-CD的包合作用研究未見報道，本實驗選取γ-CD對青藤堿分子進行包合，成功制備γ-CD與青藤堿的包合物，并通過X射線粉末衍射(XRD)、紅外光譜(IR)、差示掃描量熱分析(DSC)、核磁共振(HNMR)等技術對包合物進行表征及基本性質研究，對青藤堿作為藥品和保健品現有制劑的研究和改進具有重要的理論意義和潛在的應用價值，為環糊精在食品、保健品、化妝品等方面的開發和進一步研究應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸青藤堿(含量99.12%，批號100802) 陜西森弗生物技術有限公司；γ-環糊精(含量98.50%，批號100701)上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純；其他化學試劑均為分析純；用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

Bruker D8 X射線粉末衍射儀 德國布魯克公司；UV-2450紫外分光光度計、HPLC-10AT高效液相色譜儀(SPD-10AVP紫外檢測器)、DSC-60差示掃描量熱分析儀 日本島津公司；Nikon SMZ-1000體式研究顯微鏡 日本尼康株式會社；MAGNA-IR750型FTIR紅外光譜儀 美國Nicolet公司；INOVA-400核磁共振儀 美國Varian 公司。

1.3 方法

1.3.1 游離青藤堿的制備與純化

由于實驗所需藥品為青藤堿，需對所購鹽酸青藤堿進行游離青藤堿的制備。按文獻[16]精確稱取鹽酸青藤堿，溶于一定量的二次蒸餾水中，攪拌使之充分溶解后逐滴加入氨水，產生乳白色膠狀沉淀，繼續加氨水至不再有新的沉淀產生為止。然后用氯仿萃取，將氯仿層用新蒸蒸餾水反復萃洗至中性。氯仿層用無水硫酸鈉干燥過夜，用旋轉蒸發儀減壓蒸干得白色青藤堿粉末，放入干燥器中備用。

1.3.2 測定波長選擇

取青藤堿、γ-CD，加蒸餾水溶解，以蒸餾水作為對照，分別在紫外分光光度計200～500nm波長處進行掃描，γ-CD在此范圍內無吸收，青藤堿在265nm波長處有較大吸收，所以選擇波長265nm為青藤堿測定波長。

1.3.3γ-CD對青藤堿的增溶作用研究

分別配制濃度為0、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L的γ-CD溶液，將純化后的青藤堿加入使之達到飽和，溶液經0.45μm微孔濾膜過濾，稀釋相同倍數后利用紫外吸收光譜在265nm波長處測定其吸光度。通過測定青藤堿的含量考察γ-CD濃度對青藤堿溶解度的影響。

1.3.4 青藤堿-γ-CD包合物的制備

環糊精與客體分子形成包合物的制備方法有共沉淀法、逐步滴加法、固體混合法等多種[17-19]，通過溶液法制備環糊精與客體分子包合物是實驗室和工業生產中最常用的制備路線。因此本實驗利用溶液共混法制備青藤堿-γ-CD包合物，制備工藝如下[20]：25℃條件下，按青藤堿與γ-CD物質的量比1∶1取樣，在不斷攪拌的條件下將青藤堿緩緩加入到γ-CD的飽和水溶液中，50℃條件下攪拌3h以確保包合反應進行完全。冷卻至室溫后置于冰箱中4℃條件下放置48h，由于γ-CD在水中溶解度較大，置于冰箱中4℃左右放置48h后未見晶體析出；置于旋轉蒸發器下，50℃旋蒸出部分水，溶液出現渾濁，抽濾得少量包合物固體，小心將包合物用少量石油醚洗滌，室溫干燥，置于干燥器中，備用。

1.3.5 青藤堿-γ-CD包合物的吉布斯自由能變化

分別配制濃度為0、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L的γ-CD溶液，加青藤堿使之達到飽和，溶液經0.45μm微孔濾膜過濾，稀釋相同倍數后利用紫外吸收光譜在265nm波長處測定其吸光度，繪制青藤堿在γ-CD溶液中的溶解度曲線，并計算包合反應前后的吉布斯自由能變化。

1.3.6 青藤堿-γ-CD包合物的性質研究

將制備的青藤堿-γ-CD包合物分別通過顯微晶體、X射線粉末衍射、差示掃描量熱分析、紅外光譜及核磁共振等方式進行表征和性質分析。

2 結果與分析

2.1 γ-CD對青藤堿的增溶作用研究

圖1 γ-CD 對青藤堿增溶作用的光譜圖Fig.1 UV spectrum of SN-γ-CD inclusion complex

由圖1可知，隨著γ-CD濃度的增加，青藤堿的溶解度逐漸增大，γ-CD對青藤堿有明顯的增溶作用。

2.2 青藤堿-γ-CD包合物的相溶解度及吉布斯自由能變化研究

青藤堿的溶解度隨環糊精的加入呈線性增加，根據Benesi-Hildebrand公式，該體系相溶解度曲線方程為典型的AL型，確定青藤堿與γ-CD的包合計量比為1∶1，則相溶解度方程為式(1)。

式中：c(CD)為環糊精物質的量的總濃度/(mol/L)；c0為CD存在下客體青藤堿分子的總濃度/(mol/L)；S0為客體青藤堿分子的固有溶解度(曲線的截距)；K為包合物的形成常數/(L/mol)。

以客體濃度對CD濃度作圖，如圖2所示，由圖中的斜率和截距可獲得包合物的形成常數K，根據包合常數K計算包合前后的吉布斯自由能變化，見式(2)、(3)[21]。

圖2 青藤堿在25℃γ-CD溶液中的相溶解度圖Fig.2 Effect of γ-cyclodextrin on the solubility of sinomenine in water at 25 ℃

經計算得：青藤堿與γ-CD的包合常數為600.3L/mol，該反應的吉布斯自由能為ΔG=－15.85kJ/mol。

2.3 青藤堿-γ-CD包合物的性質

2.3.1 青藤堿與γ-CD包合物的顯微晶體分析

圖3 青藤堿、γ-CD及包合物的顯微晶體圖片Fig.3 Crystal properties of SN-γ-CD inclusion complex

將制備的青藤堿、γ-CD及包合物經純化后置于Nikon SMZ-1000體式研究顯微鏡下觀察，如圖3所示。青藤堿、γ-CD、青藤堿-γ-CD包合物存在較大區別；其中鹽酸青藤堿是針狀結晶，青藤堿是棱柱狀結晶，γ-CD沒有固定形態應為無定形結晶，青藤堿-γ-CD包合物的晶體形態不同于青藤堿也不同于γ-CD；青藤堿、γ-CD及青藤堿-γ-CD包合物顆粒的直徑大小不相同。由晶體特征可以初步推測：青藤堿與γ-CD形成的包合物應是新的晶體形態。

2.3.2 青藤堿與γ-CD包合物的X射線衍射分析

對青藤堿、γ-CD及包合物進行XRD分析，分析條件：室溫，Cu靶(Kα射線，波長=1.54187?)掃描電壓40kV，管電流40mA，掃描速率2°/min，采樣間隔為0.02°，掃描范圍5°～80°。30°以后圖譜無明顯變化，取5°～30°所得XRD圖譜如圖4所示。γ-CD的XRD峰形呈現出彌散形態，但其圖譜上明顯出現隆起并有少許強度較低的特征衍射峰出現，說明γ-CD的晶形介于微晶與晶體形態之間；在青藤堿-γ-CD的包合物圖譜上可以看出，青藤堿-γ-CD包合物的晶形與γ-CD類似，沒有良好的結晶形態；青藤堿-γ-CD包合物中出現一組明顯新的特征衍射峰(2θ= 7.42°、2θ= 14.52°、2θ= 20.34°)，此外青藤堿、γ-CD的特征衍射峰在其包合物中幾乎完全消失；青藤堿-γ-CD包合物表現出明顯不同于前兩者的新的特征性質，說明青藤堿-γ-CD包合物是一種新的物質形態。

圖4 青藤堿(a)、青藤堿-γ-CD包合物(b)與γ-CD (c) XRD比較Fig.4 X-ray diffraction of sinomenine (a), SN-γ-CD inclusion complex(b) and γ-CD (c)

2.3.3 青藤堿-γ-CD包合物的差示掃描量熱分析

圖5 青藤堿(a)、γ-CD(b)、青藤堿與γ-CD物理混合物(c)、青藤堿-γ-CD包合物(d)DSC圖Fig.5 DSC diagrams of sinomenine (a), γ-cyclodextrin (b), physical mixture (c) and inclusion complex (d)

測試條件：坩堝：鋁坩堝；參比物：Al2O3；氣氛：N2；升溫速率為10℃/min；升溫范圍為30～350℃，結果見圖5。青藤堿在160.6℃及182℃出現2個尖銳的特征吸熱峰；298℃的吸熱峰表明γ-CD的熔點在298℃左右，83℃出現的吸熱峰說明γ-CD含有少量水存在。在兩者的物理混合物的DSC圖譜中，青藤堿的吸熱峰強度顯著降低，但峰的位置沒有發生明顯變化；而在兩者的包合物的DSC圖譜中，青藤堿的吸收峰完全消失，且γ-CD的吸熱峰也沒有出現，較青藤堿和γ-CD的圖譜有明顯的差異。

2.3.4 青藤堿-γ-CD包合物的紅外光譜分析

采用KBr壓片法測定青藤堿、γ-CD、物理混合物和包合物的紅外光譜，分辨率為2cm-1，4000～400cm-1全譜掃描，所得紅外圖譜見圖6。3600cm-1左右出現的是青藤堿酚羥基的吸收峰，在3000cm-1以下有芳環骨架上的C—H伸縮振動，1688cm-1左右出現了較強的羰基吸收峰，1635、1510cm-1處出現芳環骨架振動，N—CH3及O—CH3表現為1450cm-1左右的彎曲振動。γ-CD主要紅外特征吸收峰有：3384cm-1為γ-CD上多締合體—OH的伸縮振動；2924cm-1甲基、亞甲基C—H的伸縮振動；1647cm-1，結合水振動；1417、1259cm-1—OH的平面彎曲振動；1367、1336、1303cm-1C—H彎曲振動；1156cm-1C—O—C的反對稱伸縮振動；1080、1030cm-1，C—C、C—O或C—C—O的伸縮振動。青藤堿與γ-CD的物理混合紅外光譜圖中，青藤堿的吸收峰均明顯存在，只是疊加了γ-CD的吸收峰。青藤堿與γ-CD包合物的紅外譜圖中，青藤堿的一些特征吸收峰強度明顯降低，峰形變寬，其中芳環骨架振動吸收峰產生了較大的位移(1587～1509cm-1)或者消失(1122cm-1)，單鍵伸縮振動及彎曲振動的指紋區(1300～1000cm-1)的許多吸收峰也出現消失或較大位移，如1284、1198、1145、1056cm-1等。

圖6 青藤堿(a)、γ-CD(b)、青藤堿與γ-CD物理混合物(c)及青藤堿-γ-CD包合物(d)紅外光譜圖Fig.6 IR spectra of sinomenine (a), γ-cyclodextrin (b), physical mixture(c) and inclusion complex (d)

以上紅外特征光譜的變化充分說明：γ-CD與青藤堿主客體分子間發生了相互作用，青藤堿分子進入γ-CD的空腔中，包合物已經形成。

2.3.5 青藤堿-γ-CD包合物的核磁共振分析

表1 包合物形成前后γ-CD的氫核化學位移變化Table 1 Change in 1H chemical shift of γ-CD before and after inclusion with sinomenine

對青藤堿、γ-CD及其包合物進行1HNMR分析，分析條件：DMSO-d6、400MHz、25℃，通過不同圖譜的分析比較，氫質子位移變化如表1所示。客體青藤堿分子和主體γ-CD分子包合后，γ-CD的質子發生明顯的化學位移，青藤堿的質子H在包合物的圖譜上峰高和峰面積發生很大變化。γ-CD的質子H3和H5及2—OH、3—OH、6—OH發生明顯偏移，而H2和H4的變化很小，造成這一現象的主要原因與青藤堿及γ-CD的結構密切相關。分析其可能原因是包合物形成后，青藤堿分子進入γ-CD空腔內部，由于客體分子芳香基團環電流的影響位于γ-CD空腔內壁的兩個質子H3和H5發生移動，化學位移值發生變化。青藤堿分子上的基團與環糊精分子的2—OH、3—OH、6—OH形成分子間氫鍵，電子屏蔽作用減小[22]，吸收峰將移向低場，化學位移值增大。通過青藤堿氫質子峰面積的減小及氫質子的位移變化充分說明青藤堿分子與γ-CD之間發生了作用，青藤堿分子已經進入到γ-CD空腔中。

3 結 論

通過溶液共混法成功制備了青藤堿與γ-CD的包合物，并通過晶體形態的顯微圖像、差示掃描量熱分析、紅外光譜、X射線粉末衍射及核磁共振等方式對包合物進行了基本性質的研究和分析，實驗結果證明γ-CD對青藤堿具有明顯的增溶作用，青藤堿-γ-環糊精包合物表現出明顯不同于青藤堿的特征波譜性質。利用相溶解度法計算出青藤堿與γ-CD形成的包合物的包合物質的量比均為1∶1，其包合常數為600.3L/mol，該反應的吉布斯自由能變化為ΔG=－15.85kJ/mol。實驗結論為青藤堿作為藥品和保健品的開發和現有制劑方式的改進提供重要的參考，為環糊精在食品、保健品及化妝品等工業的進一步研究應用提供一定的理論依據。

[1]LIANG Liu, EBERHARD B, DENNIS B, et al.Amelioration of rat experimental arthritis by treatment with the sinomenine[J].Int J Immunopharmac, 1996, 18(10)∶ 529-534.

[2]游素芬, 戈萌.青藤堿的醫藥新用途∶ 中國, CN1679574A[P].2005-10-12.

[3]傅紹萱.青藤堿的藥理作用Ⅱ—Ⅶ[J].藥學學報, 1963, 10(11)∶ 673-675.

[4]葉仙蓉, 顏克序, 吳克美, 等.青藤堿衍生物的合成及其抗炎鎮痛活性[J].藥學學報, 2004, 39(3)∶ 180-183.

[5]GOTO K, SUDZUKI H.Studies on bimolecular alkaloids partⅠ—Ⅱ[J].Bull Chem Soc Jpn, 1929, 4∶ 107-111.

[6]ISHIWARI N.An alkaloid of sinomeium diversifolium[J].Journal of Chemical Society Abstracts, 1921, 120∶ 1354.

[7]童林薈.環糊精化學-基礎與應用[M].北京∶ 科學出版社, 2001∶ 11-25.

[8]DAVIS M E, BREWSTER M E.Cyclodextrin-based pharmaceutics∶ past,present and future[J].Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3(12)∶ 1023-1035.

[9]SONG Li, PURDY W C.Cyclodextrins and their applications in analytical chemistry[J].Chem Rev, 1992, 92(6)∶ 1457-1470.

[10]MONTASSIER P, DUCHENE D, POELMAN M C.Inclusion complexes of tretinoin with cyclodextrins[J].International Journal of Pharmaceutics, 1997, 153(2)∶ 199-209.

[11]王曉云, 姜子濤, 李榮.環糊精及其衍生物與天然抗氧化劑楊梅素的包合作用研究[J].食品科學, 2008, 29(5)∶ 125-128.

[12]SZEJTLI J, SZENTE L.Elimination of bitter, disgusting tastes of drugs and foods by cyclodextrins[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharm Aceutics, 2005, 61(3)∶ 115-125.

[13]程霜, 杜凌云, 牛梅菊, 等.β-環糊精和染料木黃酮包合作用的研究[J].食品科學, 2006, 27(2)∶ 94-99.

[14]STRICKLEY R G.Solubilizing excipients in oral and injectable formulations[J].Pharmaceutical Research, 2004, 21(2)∶ 201-230.

[15]GUO X, SHUANG S, WANG X, et al.Comparative study on the inclusion behaviour of cyclodextrin derivatives with venoruton and rutin by thin layer chromatography[J].Biomedical Chromatography, 2004, 18(8)∶ 559-563.

[16]羅烈.青藤堿衍生物的合成及鎮痛抗炎作用的定量構效關系研究[D].武漢∶ 武漢大學, 2005.

[17]國家藥典委員會ISBN978-7-5067-4439-3, 2010.1中國藥典二部[S].北京∶ 中國醫藥科技出版社, 2010.

[18]FERNANDES C M, VEIGA fJ B.The cyclodextrins in pharmacol technology.Ⅲ.Preparation and characterization of inclusion complexes in solid state[J].Revista de Ciencias Farmaceuticas, 1999,20(2)∶ 375-387.

[19]續浩, 陳亮.環糊精包結物的制備與研究方法[J].分析測試技術與儀器, 2001, 7(3)∶ 143-151.

[20]朱士龍, 李勇, 林紅衛, 等.青藤堿-環糊精包合工藝的優化及包合常數測定[J].食品科學, 2012, 33(8)∶ 54-59.

[21]傅獻彩, 沈文霞.物理化學[M].5版.北京∶ 高等教育出版社, 2006∶ 165-166.

[22]姚新生.有機化合物波譜分析[M].北京∶ 中國醫藥科技出版社,2004∶ 126-127.