美拉德反應對醋蛋多肽抗氧化活性的影響

楊 鋒，陳錦屏，林心怡

(1.陜西師范大學生命科學學院，陜西 西安 710062；2.廣西工學院生物與化學工程系，廣西 柳州 545006)

醋蛋是流傳于民間的一項驗方，以米醋為基質，加入雞蛋浸泡而成。醋使蛋清中的蛋白分子降解，釋放出具有活性的蛋白寡肽及氨基酸[1]。研究[2-4]表明醋蛋中的活性肽具有很強的血管緊張素轉換酶抑制作用，具有降血壓功能。另外，陳黎斌等[5]用胃蛋白酶-胰酶復合酶體系水解醋蛋液，發現醋蛋水解液具有一定的抗氧化活性。

美拉德反應是食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質)與羰基化合物(糖類)發生的復雜反應，已有研究[6]表明美拉德反應產物中的類黑精、還原酮以及一些含N、S的雜環化合物具有抗氧化活性。沈晗等[7]研究發現醬渣多肽的美拉德熱反應產物具有較高的抗氧化活性和很好的應用價值；孟艷麗等[8]采用鰱魚肽與葡萄糖發生美拉德反應，結果表明美拉德反應產物表現出很好的抗氧化活性。Benjakul等[9]研究豬血蛋白和還原糖的美拉德反應，發現美拉德反應產物也具有抗氧化活性，并且抗氧化活性與體系的褐變程度和中間產物的形成有關。Gu等[10]研究酪蛋白和葡萄糖美拉德反應產物的抗氧化活性，結果表明不同分子質量的美拉德反應產物具有不同的抗氧化活性。本實驗采用醋蛋多肽與葡萄糖發生美拉德反應，研究美拉德反應對醋蛋多肽抗氧化活性的影響，為進一步提高醋蛋液的開發價值提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋購于廣西柳州潭中市場；9°米醋王 廣東美味鮮調味食品有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 上海楷洋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

WFZ UV-2000型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；TGL-16G離心機 上海安亭科學儀器廠；RE-52旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；FD-2冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-3D精密pH計上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 醋蛋多肽的制備

挑選大小均一的雞蛋，洗去表面污垢，用75%酒精擦拭雞蛋表面，晾干后稱質量，以醋蛋比3∶1(V/m)加入米醋于20～25℃密封浸泡36h，挑破蛋膜，用紗布過濾，得醋蛋液。將醋蛋液煮沸后于5000r/min離心20min，取上清液減壓濃縮后凍干得醋蛋多肽，備用。

1.3.2 美拉德反應

取0.2g醋蛋多肽粉末，溶于20mL蒸餾水，按不同醋蛋多肽、葡萄糖質量比例加入葡萄糖，用1mol/L的NaOH溶液調節pH值至所需值，置于不同溫度條件下反應至所需時間，得到反應樣品液，備用。

1.3.3 抗氧化活性的測定

1.3.3.1 Fe3+還原能力的測定

參照Oyaizu[11]的方法，略作修改。取1mL樣品液于具塞試管中，加入2.5mL 0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5mL 10g/100mL的K3Fe(CN)6溶液并混合均勻，于50℃保溫20min后快速冷卻，加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸溶液，過濾。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和1mL 0.1g/100mL的FeCl3，混合均勻，靜置10min 后測定700nm波長處的吸光度，吸光度越大，樣品的還原能力越強。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照Tang Chuanhe等[12]的方法，略作修改。用無水乙醇配制0.1mmol/L DPPH溶液，避光保存。將2mL樣品液及2mL DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，室溫條件下靜置30min后于517nm波長處測定其吸光度(At)，同時測定DPPH 溶液與2mL蒸餾水混合后的吸光度(Ac)，以及2mL樣品液與2mL無水乙醇混合后的吸光度(Ab)。按照式(1)計算DPPH自由基清除率，清除率越大則抗氧化能力越強。

1.3.4 美拉德反應過程中指標的測定

1.3.4.1 pH值

反應后的樣品液直接用pH計測定pH值。

1.3.4.2 294、420nm波長處的吸光度

將反應后的樣品液用蒸餾水稀釋5倍后，用蒸餾水做空白對照，在紫外-可見分光光度計上測定294、420nm波長處的吸光度。

1.3.4.3 接枝度

參照Lertittikul等[13]的方法，略作修改。取反應后的樣品液0.4mL與 2mL pH8.2的磷酸鹽緩沖液混合，再加入1mL 0.01g/100mL TNBS試劑，振蕩混勻，在50℃水浴中避光反應30min，然后再加入2mL 0.1mol/L Na2SO3溶液終止反應，在室溫條件下放置30min后在420nm波長處測吸光度?？瞻讓φ帐窃谙嗤僮鳁l件下以蒸餾水代替0.01g/100mL TNBS試劑。按式(2)計算接枝度。

式中：A0表示未反應時樣品吸光度；At表示反應t時間后樣品吸光度。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應條件對反應產物抗氧化活性的影響

2.1.1 醋蛋多肽、葡萄糖質量比對反應產物抗氧化活性的影響

圖1 醋蛋多肽、葡萄糖質量比對反應產物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of the ratio between peptide from vinegar-egg and glucose on antioxidant activity of Maillard reaction products

在反應初始pH9、反應溫度90℃、反應時間90min的條件下，改變葡萄糖的添加量，考察醋蛋多肽、葡萄糖質量比對反應產物抗氧化活性的影響。由圖1可知，不同醋蛋多肽與葡萄糖反應質量比對反應產物抗氧化活性有一定程度的影響。隨著葡萄糖添加量的增大，反應產物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力有所升高，當醋蛋多肽與葡萄糖的質量比達到1∶2時，反應產物的抗氧化活性最強，其中DPPH自由基清除率為58.1%、Fe3+還原能力(A700nm)為0.653，繼續增加葡萄糖的用量，反應產物的抗氧化活性反而有所下降，這與朱敏[14]的研究結果相似，即在研究精氨酸和木糖的美拉德反應產物的抗氧化活性時發現精氨酸和木糖的物質的量比為1∶1時，產物的抗氧化活性最好，比例過高或過低都會影響產物的抗氧化活性，其中的原因有待于進一步研究。因此，在進行美拉德反應時，選擇醋蛋多肽、葡萄糖的質量比為1∶2。

2.1.2 反應初始pH值對反應產物抗氧化活性的影響

美拉德反應產物的抗氧化活性與反應初始pH值密切相關，因為pH值影響著氨基酸的存在形式，進而影響到美拉德反應的進程。高pH值有利于美拉德反應的起始縮合反應的進行，也有助于糠醛類產物經Amadori重排成還原酮類產物，引起褐變，而褐變的程度與產物的抗氧化活性直接相關[13]。在醋蛋多肽、葡萄糖的質量比為1∶2、反應溫度90℃、反應時間90min的條件下，改變反應初始pH值，考察反應初始pH值對反應產物抗氧化活性的影響。由圖2可知，反應產物的DPPH自由基清除率隨著反應初始pH值的增大而增加，在pH值為10時達到最大，之后又下降； Fe3+還原能力也隨著反應初始pH值的增大而增加，在pH值為9時最大，之后有所降低，但是下降幅度不大。所以綜合來看，選擇反應初始pH值為10。

圖2 反應初始pH值對反應產物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of reaction initial pH on antioxidant activity of Maillard reaction products

2.1.3 反應溫度對反應產物抗氧化活性的影響

圖3 反應溫度對反應產物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on antioxidant activity of Maillard reaction products

在醋蛋多肽、葡萄糖的質量比為1∶2、反應初始pH10、反應時間90min的條件下，改變反應溫度，考察反應溫度對反應產物抗氧化活性的影響。由圖3可知，反應溫度對反應產物的抗氧化活性影響很大，在低于100℃時，反應產物的抗氧化活性隨著反應溫度的增加而迅速增大，當反應溫度超過100℃時，繼續升高反應溫度，反應產物的活性增幅不大。因此選擇反應溫度為100℃。

2.1.4 反應時間對反應產物抗氧化活性的影響

圖4 反應時間對反應產物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of reaction time on antioxidant activity of Maillard reaction products

在醋蛋多肽、葡萄糖的質量比為1∶2、反應初始pH10、反應溫度100℃的條件下，改變反應時間，考察反應時間對反應產物抗氧化活性的影響。由圖4可知，反應產物的抗氧化活性隨著反應時間的延長而不斷增加，在反應進行到120min時，反應產物的抗氧化活性趨于穩定，并且繼續反應到180min時活性變化不大。因此，選擇反應時間120min。

2.2 美拉德反應產物抗氧化活性與美拉德反應進程之間的關系

表1 美拉德反應產物的抗氧化活性與反應進程之間的關系Table 1 Correlation between antioxidant activity of Maillard reaction products and the process of Maillard reaction

為探討醋蛋多肽與葡萄糖進行美拉德反應后反應產物抗氧化活性的變化與美拉德反應進程之間的關系，在上述優化的美拉德反應條件下，即醋蛋多肽、葡萄糖的質量比為1∶2、反應初始pH10、反應溫度100℃，測定了美拉德反應進程中體系pH值的變化、中間產物(A294nm)的變化、褐變程度(A420nm)的變化、接枝度的變化以及抗氧化活性的變化。由表1可知，在醋蛋多肽與葡萄糖進行美拉德反應過程中，體系的pH值隨反應的進行不斷下降，且在120min內下降幅度較大，之后趨于平穩。這可能是因為美拉德反應作用了一部分氨基，羰氨縮合反應封閉了游離的氨基，致使反應體系的pH值下降；另一方面由于美拉德反應產生一些有機酸，如乙酸和蟻酸，也使體系的pH值下降[15]。A294nm反映的是美拉德反應過程中產生的無色中間產物量的變化[16]，這些無色中間產物主要是由糖裂解產生的酮、醛類等小分子物質[17]。在反應120min內，A294nm急劇增大，而后繼續反應此吸光度變化不大。說明這些無色中間產物主要在反應的前120min內生成并積累到一定濃度，繼續反應，這些中間產物之間或與肽等發生聚合反應，進入美拉德反應的終極階段，生成大分子的褐色物質[17]。A420nm反映的是體系的褐變程度[18]。反應時間短，體系的顏色較淺，隨著反應時間的延長，吸光度增加，體系的顏色逐漸加深，表明形成了褐色的聚合體——類黑精。類黑精是一種以短肽和色素相結合的混合體，是美拉德反應產物中的主要抗氧化成分[19]。在反應前120min內，產物的褐變程度明顯，A420nm增幅較大，之后變化較小。綜合產物抗氧化活性隨反應時間的變化結果來看，隨著美拉德反應時間的延長，產物的抗氧化能力也顯著增強，在120min后變化不大，這一變化趨勢與體系褐變程度的變化趨勢一致，說明美拉德反應產物的抗氧化活性與體系的褐變程度有關。接枝度是通過測定體系自由氨基的減少來計算的，反映的是美拉德反應進行的程度[20]。接枝度越小，表明美拉德反應程度越低；接枝度越大，表明美拉德反應程度越高。接枝度隨著反應時間的延長而不斷上升，表明美拉德反應一直進行，當反應時間達到120min后，接枝度的變化趨于平穩，綜合產物抗氧化活性隨反應時間的變化結果來看，反應產物的抗氧化活性隨著反應時間的延長而不斷增加，反應120min后，反應產物抗氧化活性的增加也趨于平穩，這也進一步說明反應產物的抗氧化活性與美拉德反應進行的程度有關。

3 結 論

3.1 利用醋蛋多肽與葡萄糖進行美拉德反應的優化工藝條件為：醋蛋多肽、葡萄糖質量比為1∶2、反應初始pH10、反應溫度100℃、反應時間120min。在此條件下，反應產物的抗氧化活性與醋蛋多肽相比，DPPH自由基清除率從12.7%增加到64.8%，Fe3+還原能力(A700nm)從0.107增加到0.718。因此，美拉德反應是提高醋蛋多肽抗氧化活性的有效方法。

3.2 反應產物的抗氧化活性與美拉德反應進行的程度有關，反應產物的抗氧化活性隨著體系pH值的降低、中間產物(A294nm)的增加、褐變程度(A420nm)的增加以及接枝度的增加而不斷增強。

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