嗜熱鏈球菌中CRISPR序列的檢測(cè)與同源性分析

鄧凱波，霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

自古以來(lái)，乳酸菌就是人們廣泛使用的一類益生菌。現(xiàn)代工業(yè)中，益生菌發(fā)酵制品種類繁多，很多乳酸菌被用作發(fā)酵劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，其中嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)為應(yīng)用最廣泛的乳酸菌之一。然而，由于噬菌體污染而導(dǎo)致的生產(chǎn)失敗已造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管研究者們已采取了許多手段[1]，但收效甚微。

規(guī)律成簇的間隔回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以“重復(fù)序列-間隔區(qū)(repeat-spacer)”為單元組成了原核生物基因組上的一段非編碼區(qū)，是專門針對(duì)噬菌體及質(zhì)粒等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng)[2-4]。CRISPR序列的典型結(jié)構(gòu)為21～48bp的重復(fù)序列和其間插入的相似長(zhǎng)度的非重復(fù)間隔序列組成[2]。目前，嗜熱鏈球菌CRISPR序列結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理方面的研究?jī)H在Streptococcus thermophilusDGCC 7710中最為詳盡[5-9]，我國(guó)尚無(wú)相關(guān)報(bào)導(dǎo)。探明我國(guó)嗜熱鏈球菌中的CRISPR序列結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)化研究以及今后噬菌體抗性突變菌株的構(gòu)建都具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8株嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)S0、S4、S06、S07、S14、S18、St和SM由KLDS-DICC保藏；E.coliDH5α為實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoRI、PCR體系中的GC bufferⅠ、LA Taq擴(kuò)增酶 日本TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

GM17培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、胰蛋白胨5.0g、抗壞血酸0.5g、牛肉浸膏2.5g、β-甘油磷酸二鈉19g、瓊脂15g，1.0mol/L MgSO4·7H2O 1.0mL，蒸餾水定容至1L，118℃滅菌20min。固體GM17培養(yǎng)基另添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用蒸餾水定容至1L，調(diào)至pH 7.0，118℃條件下滅菌20min。固體LB培養(yǎng)基另添加1.5%的瓊脂。

氨芐霉素LB培養(yǎng)基(LB-Amp+)：LB培養(yǎng)基配制滅菌后，溫度降至55℃左右，添加終質(zhì)量濃度為100μg/mL的氨芐霉素，搖勻后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

580BR 5360型梯度PCR儀 美國(guó)伯樂公司；9700 PCR System 美國(guó)ABI公司；DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠；UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜熱鏈球菌CRISPR序列引物設(shè)計(jì)

根據(jù)CRISPR database(http∶//crispr.u-psud.fr/crispr/)公布的S.thermophilusLMD-9全序列菌株的3個(gè)CRISPR序列信息設(shè)計(jì)3對(duì)引物分別為：P1(正向引物：5’-GAATCACTATGTGGGTATG-3’，反向引物：5’-TTCAGGTGTTTACGGACT-3’)、P2(正向引物：5’-CTTTAGGGTAATGGCGTGAGGGTG-3’，反向引物：5’-ACTTTCTGGAAGCGGTGGCAATAA-3’)和P3(正向引物：5’-GAGGCTACCTGAATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGCTCTGTATGAAGTTGAATGGG-3’)，引物設(shè)計(jì)采用Primer premier 5軟件。

1.3.2 引物退火溫度確定

采用梯度PCR方法對(duì)3對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行摸索，采用小劑量擴(kuò)增體系，分別以S0、St和SM基因組DNA為模板，根據(jù)電泳結(jié)果確定最佳退火溫度。

1.3.3 CRISPR序列擴(kuò)增

3對(duì)引物分別對(duì)供試菌株基因組進(jìn)行CRISPR序列擴(kuò)增，反應(yīng)緩沖液采用GC bufferⅠ，擴(kuò)增酶為L(zhǎng)A Taq，并采用最佳退火溫度，電泳鑒定結(jié)果。

1.3.4 CRISPR序列片段連接轉(zhuǎn)化和鑒定

回收得到目的片段與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)目的片段測(cè)序。

1.3.5 CRISPR序列BLAST比對(duì)和同源性分析

測(cè)序結(jié)果用BLAST CRISPR進(jìn)行基因同源性比對(duì)，得到并構(gòu)建出該菌株的CRISPR序列結(jié)構(gòu)，以及重復(fù)序列(DR)和間隔區(qū)序列(spacer)。并將得到的CRISPR序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株CRISPR序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.3.6 重復(fù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用CLC sequence viewer 6對(duì)供試菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的DR進(jìn)行多重比對(duì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行DNA sequence logo(http∶//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)作圖，并采用RNAfold web server (http∶//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)預(yù)測(cè)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火溫度確定

分別用P1、P2和P3對(duì)S.thermophilusS14、St和SM基因組進(jìn)行梯度擴(kuò)增，對(duì)退火溫度梯度設(shè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3對(duì)引物溫度梯度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel pattern of gradient PCR products by three pairs of primers

由圖1可知，3對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物效率均隨著溫度有遞增或遞減變化，確定P1、P2和P3的退火溫度范圍可分別在52.3～62.0℃、50.0～59.6℃和50.0～54.4℃，據(jù)此確定3對(duì)引物最佳退火溫度均為52.3℃。

2.2 CRISPR序列的擴(kuò)增與測(cè)序

按照最佳退火溫度，分別用P1、P2和P3對(duì)8株供試嗜熱鏈球菌的CRISPR序列進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，CRISPR詳細(xì)信息見表1。

表1 嗜熱鏈球菌CRISPR信息Table 1 Information of Streptococcus thermophilus CRISPR

圖2 CRISPR序列擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Agarose gel pattern of CRISPR amplification

由圖2和表1可知，在所有供試菌株的CRISPR擴(kuò)增中，只有S4在以P2和P3為引物的條件下無(wú)擴(kuò)增結(jié)果，說(shuō)明在此菌株中不存在該兩段序列，其他得到理想的擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)測(cè)序和CRISPR Finder分析后，均鑒定為CRISPR序列，存在率達(dá)到100%，遠(yuǎn)高于CRISPR database公布的在細(xì)菌范圍內(nèi)的比例(46.4%，截止至2011年10月)。CRISPR最短僅為101bp，存在1個(gè)Spacer(S0和S6)；最長(zhǎng)為2853bp，其中包含43個(gè)Spacer(S4)。對(duì)于8株供試菌株，3對(duì)引物對(duì)應(yīng)的CRISPR中DR序列相同，大小為30～38bp，但其DR-Spacer單元的數(shù)量并不一致。CRISPR在一定程度上可反應(yīng)出細(xì)菌的進(jìn)化歷程[10]，這種現(xiàn)象也許是由于菌株生長(zhǎng)環(huán)境不同造成的序列差異的結(jié)果。

將P1、P2和P3相對(duì)應(yīng)的DR序列分別命名為：DR1(5’-GATATAAACCTAATTACCTCGAGAGGGGACGGA AAC-3’)、DR2(5’-GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGT AACTGTACAAC-3’)和DR3(5’-GTTTTAGAGCTGTGTT GTTTCGAATGGTTCCAAAAC-3’)。

2.3 DR序列同源性比較

分別對(duì)這3種DR進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)(E值＜0.1)，結(jié)果見表2。DR1～DR3的高同源性(E值＜0.1)的菌株均為乳球菌屬，這與其菌屬親緣關(guān)系具有一定的一致性；其中DR1高同源性菌株僅4株，其中前3株均與供試菌株同種，且同源性為100%；與DR2同源性100%菌株除嗜熱鏈球菌外，有一株為S.gordoniistr.Challissubstr.CH1，另外還有若干S.thermophilusDGCC7710的突變體分離株(*號(hào))；這一現(xiàn)象在DR3中更為明顯，而同為嗜熱鏈球菌的S.thermophilusCNRZ1066和S.thermophilusLMG 18311，其同源性卻相對(duì)較低。這種同種不同源，同源卻不同種的現(xiàn)象已在多種細(xì)菌的CRISPRs序列中發(fā)現(xiàn)[11-15]，研究者們將這種現(xiàn)象稱為水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)，與基因轉(zhuǎn)座類似，這種機(jī)制也許能增強(qiáng)菌株的環(huán)境適應(yīng)力和功能基因的傳播。

表2 CRISPRDR同源性比對(duì)結(jié)果Table 2 Homology alignment of CRISPR DR

2.4 重復(fù)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

重復(fù)序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3～5所示。其中二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)均采用中心二級(jí)結(jié)構(gòu)法(centroid secondary structures)，并記錄形成結(jié)構(gòu)的最小自由能(kcal/mol)。

圖3 DR1高同源性序列多重比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Multiple alignment and second structure prediction of DR1 with high homology

圖4 DR2高同源性序列多重比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Multiple alignment and second structure prediction of DR2 with high homology

圖5 DR3高同源性序列多重比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Multiple alignment and second structure prediction of DR3 with high homology

由圖3～5可知，DR1～DR3的高同源群一致序列均為36bp，可形成類似發(fā)夾環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。其中，DR1(圖3c)環(huán)頭部?jī)H為6堿基組成，莖區(qū)長(zhǎng)4堿基；而2DR(圖4c)頭部為21堿基形成的大環(huán)，莖區(qū)為6堿基。對(duì)于頭部大小對(duì)DR功能的影響尚無(wú)報(bào)道。尾部差異也比較大，其中，DR1(圖3c)尾部長(zhǎng)達(dá)16和8堿基，DR2(圖4c)適中，為4和1堿基，而DR3(圖5c)除頭部外，按照最小自由能原則，均形成了莖區(qū)，尾部沒有游離堿基。各圖b中，重復(fù)結(jié)構(gòu)一致序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，均形成了發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)(圖3c、4c、5c)。3個(gè)高同源群二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為：DR1群：－7.10kcal/mol；DR2群：－3.71kcal/mol；DR3群：－4.60kcal/mol。

據(jù)推測(cè)，回文結(jié)構(gòu)可能與新Spacer的效率有關(guān)。新增間隔區(qū)通常會(huì)插入CRISPR前導(dǎo)序列與第一個(gè)DR之間[5,16]。在內(nèi)切酶將切口打開后，較大的游離尾巴顯然會(huì)對(duì)Spacer的插入比較有利。這一推測(cè)很可能影響到CRISPR對(duì)外源染色體的抵抗作用。

3 結(jié) 論

8株供試嗜熱鏈球菌均檢測(cè)出CRISPR序列，其中S4具有1條，其余7株均含有3條，并整理出3類DR序列，長(zhǎng)度為30～38bp。另外3類DR均可形成回文結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)了CRISPR結(jié)構(gòu)的特殊性，莖區(qū)長(zhǎng)度與堿基可能與Spacer的插入有關(guān)；DR與個(gè)別遠(yuǎn)緣種的高同源性表明其存在水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，并可能與16S rDNA相比經(jīng)歷了相對(duì)不同的進(jìn)化途徑。CRISPR序列的檢測(cè)將對(duì)今后針對(duì)我國(guó)野生嗜熱鏈球菌噬菌體抗性菌株的開發(fā)提供基礎(chǔ)平臺(tái)，且由于CRISPR抗噬菌體作用方式為食品級(jí)安全，所以對(duì)其廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中是非常有利的。

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