抗玉米赤霉烯酮單抗獨特型抗體制備與鑒定

余 濤，李大剛，鄧 寧，向軍儉，宋其芳，賈彥瓊，王 宏,*

(1.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；2.廣東省農業科學院畜牧研究所，廣東 廣州 510640)

玉米赤霉烯酮是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌產生的有毒次級代謝產物，廣泛存在于大量谷物，如玉米、大麥、燕麥、小麥、水稻和高粱等[1]。盡管ZEN的毒性較低，但是對哺乳動物的影響超過雌性激素，研究表明[2]ZEN及其代謝物可以引起豬、牛、家禽的雌激素過多癥，以及生殖系統紊亂等癥狀。此外ZEN具有細胞毒性，并且在體內外表現出潛在的遺傳毒性[3]，同樣對人類也會產生諸如此類的毒害。因此歐盟及許多國家制定了谷物及飼料中ZEN最大限量標準[4-5]。

目前用于分析谷類糧食、飼料及食品中ZEN含量的方法主要有薄層色譜(TLC)[6]、高效液相色譜(HPLC)[7]、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)[8-9]等。ELISA法已被AOAC批準為玉米、小麥、飼料中ZEN的快速篩選方法[10]。免疫學測定法特點是特異性強、靈敏度高，并且可以現場篩選大量樣品。然而由于ZEN免疫學測定法涉及到使用毒素標準品，包括游離物和偶聯物，可能對研制者和使用者帶來毒害。近來，許多科研機構都在研制半抗原的替代品，如利用噬菌體庫篩選多肽模擬ZEN[11]；應用抗獨特型抗體(antiidiotype antibody，Aid)模擬皮質醇等[12-13]。抗獨特型抗體是針對抗體獨特型產生的抗體[14]，根據獨特型的不同，分為幾種類型，其中能夠結合抗原抗體結合部位的Aid稱之為Ab2 β，Jerne 稱之為抗原的“內影像”，可以模擬抗原的三維結構。本研究是在已制備抗ZEN單抗(Ab1)的基礎上，用IgG-KLH偶聯物免疫BALB/c小鼠，制備抗ZEN單抗獨特型抗體(多抗)，并研究抗獨特型抗體與ZEN之間的“內影像”關系，為抗ZEN單抗獨特型抗體替代ZEN標準品用于ELISA檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ZEN毒素標準品、HRP標記的鏈霉親和素、HRP標記的羊抗鼠IgG(Fc特異性)二抗 美國Sigma公司；HRP標記的羊抗鼠IgG(Fab特異性)二抗 美國Santa公司；固定化胃蛋白酶、生物素標記試劑盒、匙孔血藍蛋白(KLH)、BCATMprotein試劑盒 美國Thermo公司；細胞培養基RPMI-1640、小牛血清 Gibico公司；Protein G親和層析柱 美國GE公司；Quickadjuvant佐劑 北京優尼康生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 動物及細胞系

3只BALB/c小鼠(6～8 周齡，雌性) 南方醫科大學實驗動物中心；抗ZEN單抗1G4雜交瘤細胞株、IgG2b亞類 本實驗室保存。

1.3 儀器與設備

Multiskan MK3 酶標儀、細胞培養箱 美國Thermo公司；Eppendorf centrifuge 5417R離心機 德國Eppendorf 公司；PowerPac HCTM 電泳儀 美國Bio-Rad公司；TS-2 型脫色搖床 海門市麒麟醫用儀器廠；超凈工作臺 蘇州凈化設備廠；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.4 方法

1.4.1 抗ZEN單抗腹水制備及抗體純化

復蘇凍存的抗ZEN單抗的雜交瘤細胞并擴大培養，每只BALB/c小鼠提前注射0.5mL弗氏不完全佐劑，1周后每只小鼠腹腔內接種1×106個雜交瘤細胞，7～10d后抽取腹水。先采用飽和硫酸銨法粗純腹水，再用Protein G親和層析柱進行純化，SDS-PAGE鑒定單抗純化效果。

1.4.2 抗ZEN單抗Fab片段制備及鑒定

不同類或亞類抗體的片段化需要選擇不同的蛋白酶，對于IgG2b亞類的抗體需要用固定化胃蛋白酶進行酶切，此亞類抗體對胃蛋白酶非常敏感，而且酶切產物為Fab/c[15]。首先摸索最佳酶切時間，分別設定酶切時間為1、2、3、4h，37℃條件下進行酶切，具體步驟參考Pierce固定化胃蛋白酶說明書。選擇最佳酶切時間后進行大量的酶切IgG抗體(1～10mg)，酶切產物經Protein G親和層析柱純化并濃縮后，分裝保存于－20℃，同時采用凝膠電泳和ELISA法對單抗Fab片段活性進行鑒定。

1.4.3 免疫原抗ZEN單抗-血藍蛋白(KLH)偶聯物的制備

抗ZEN單抗為鼠源性抗體，如果用單抗直接免疫BALB/c小鼠，免疫原性很弱，需要將抗ZEN單抗進行修飾。參考Toshifumi等[13]，通過化學偶聯劑EDC IgG與KLH偶聯，將25.6mg EDC加入4mg/mL IgG溶液(PBS，500μL)中，室溫攪拌反應30min，然后加入2mg/mL的KLH溶液(PBS，1mL)，4℃反應過夜，反應產物用PBS透析2d，即獲得免疫原 IgG-KLH偶，分裝并保存于－20℃備用。

1.4.4 動物免疫

使用Quickadjuvant高效免乳化佐劑進行免疫，此佐劑的特點是免疫劑量少、免疫周期短，并且可以保持免疫原活性。以免疫原IgG-KLH偶聯物免疫3只BALB/c小鼠，免疫劑量為每只小鼠50μg，等體積免疫原與佐劑(各50μL)快速混勻后，小腿肌肉注射，免疫周期為3周，共免疫3次。

1.4.5 血清分離及純化

第3次免疫后2周，摘眼球取血，37℃放置1h，然后4℃過夜，3000r/min離心10min，收集上清即為血清。采用辛酸-硫酸銨進行純化，BCA試劑盒測定純化抗體質量濃度。

1.4.6 抗ZEN單抗生物素標記

由于本研究中制備的抗獨特型抗體為鼠源性多抗，為了方便研究抗獨特型抗體與ZEN之間內影像關系，需要將抗ZEN單抗進行生物素標記，建立生物素-鏈霉親和素檢測系統。標記過程參考Pierce 生物素標記試劑盒說明書，將3.5mg Ab1溶入1mL 0.01mol/L PBS(pH7.2)中，然后加入51μL 20mmol/L NHS-LC-Biotin溶液，室溫反應1h，用Zeba脫鹽離心柱對反應產物進行脫鹽，即獲得Biotin-ZEN單抗。

1.4.7 抗ZEN單抗獨特型抗體鑒定

采用間接ELISA測定抗獨特型抗體效價，將檢測原Fab用包被緩沖液稀釋至0.5μg/mL，加入96孔酶標板，每孔100μL，37℃孵育3h；300μL磷酸鹽-吐溫溶液(PBST)洗板3次；加入200μL 5%脫脂乳粉，37℃封閉1h；300μL PBST洗板3次；加入100μL倍比稀釋的抗血清，37℃孵育1h；300μL PBST洗板3次；加入100μL 1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG(Fc特異性)二抗，37℃孵育40min；300μL PBST洗板5次；加入100μL TMB底物，避光顯色10min；加入50μL 2mol/L硫酸終止反應，酶標儀測定OD450nm值，當其在1.0左右時，抗血清稀釋倍數就是其效價。

間接競爭ELISA測定抗獨特型抗體靈敏度，操作過程類似于間接ELISA，不同處為同時加入50μL不同濃度的ZEN競爭物和50μL 2倍于抗獨特型抗體效價的抗血清。

1.4.8 替代標準曲線建立

間接ELISA測定Biotin-ZEN單抗的效價，包被緩沖液將檢測原ZEN-BSA稀釋至0.5μg/mL，加入96孔酶標板，每孔100μL，37℃孵育3h；300μL PBST洗板3次；加入200μL 5%脫脂乳粉，37℃封閉1h；300μL PBST洗板3次；加入倍比稀釋的Biotin-ZEN單抗，每孔100μL，37℃孵育1h；300μL PBST洗板3次；加入100μL 1∶800稀釋的HRP標記的鏈霉親和素，37℃孵育40min；300μL PBST洗板5次；加入100μL TMB底物，避光顯色10min；加入50μL 2mol/L硫酸終止反應，酶標儀測定OD450nm值，OD450nm值在1.0左右時的抗體稀釋倍數為Biotin-ZEN單抗的效價。

采用間接競爭ELISA研究ZEN與替代物抗獨特型抗體之間的相關性，首先建立ZEN毒素或抗獨特型抗體競爭抑制曲線，過程如上所述，不同之處為同時加入50μL系列質量濃度(0.5～160ng/mL)的ZEN標準品或系列質量濃度(0.098～6.250μg/mL)的抗獨特型抗體和50μL 2倍于效價的Biotin-ZEN單抗。根據統計學繪制在相同抑制率條件下，ZEN質量濃度(μg/mL)與抗獨特型抗體質量濃度(ng/mL)間的相關性曲線。

2 結果與分析

2.1 抗ZEN單抗純化效果鑒定

圖1 腹水及純化腹水的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of ascites and purified ascites

采用12%分離膠的SDS-PAGE鑒定抗ZEN單抗純度，結果如圖1所示，純化后的單抗只有2條帶，分別是50kD處的重鏈和25kD的輕鏈，表明抗體純度很高。

2.2 抗ZEN單抗Fab片段特性鑒定

圖2 非變性PAGE研究酶切時間對IgG片段化的影響(a)和非還原SDS-PAGE鑒定Fab抗體片段(b)Fig.2 Effect of digestion time on pepsin digestion of IgG assessed by native-PAGE and the identification of Fab fragment by non-reduced SDS-PAGE

抗ZEN單抗酶切產物進行非變性凝膠電泳，結果如圖2a所示，酶切1h獲得的片段化抗體最多，隨著酶切時間的增加，片段化抗體逐漸減少，因此選擇酶切時間為1h。酶切產物經Protein G層析柱純化，非還原性SDSPAGE鑒定純化后產物，圖2b顯示酶切片段分子質量為50kD，與抗體片段Fab大小吻合。

采用間接ELISA和間接競爭ELISA鑒定Fab片段活性，結果如表1所示，Fab片段的比效價比抗ZEN單抗低，但靈敏度較完整抗體提高了3倍，表明制備的Fab片段活性較好，可以作為檢測原，用于檢測抗ZEN單抗獨特型抗體。

表1 抗ZEN單抗與抗體片段Fab特性對比Table 1 Characteristic comparison of anti-ZEN monoclonal antibody and Fab fragment

2.3 抗ZEN單抗獨特型抗體特性鑒定

表2 間接ELISA測定抗血清效價Table 2 Indirect ELISA determination of antiserum titer

間接ELISA測定三免后抗血清效價，從表2可知，1、2、3號鼠的抗血清效價分別為1∶3200、1∶1600、1∶400。同時采用間接競爭ELISA測定3只小鼠抗血清靈敏度(圖3)，其中1號鼠的靈敏度最高，競爭物ZEN的IC50值為33.8ng/mL，檢出限(IC10)為0.06ng/mL，因此選擇純化1號鼠抗血清，共獲得0.3mL純化抗體，BCA試劑盒測得純化抗體的質量濃度為10mg/mL。

圖3 間接競爭ELISA檢測抗血清對ZEN的抑制曲線Fig.3 Inhibitory curve of antiserum against ZEN determined by indirect competitive ELISA

2.4 抗ZEN單抗獨特型抗體與ZEN間“內影像”關系

首先間接ELISA測定Biotin- ZEN單抗的工作濃度為1∶40000，以Biotin- ZEN單抗為反應抗體，分別以不同質量濃度的ZEN毒素或抗ZEN單抗獨特型抗體為競爭物，建立競爭抑制曲線。由圖4可知，抗獨特型抗體能否替代ZEN實現無毒檢測，必須分析抗ZEN單抗獨特型抗體與ZEN之間的相關度，根據抑制率在20%～80%間，在相同抑制率條件下，ZEN質量濃度與抗獨特型抗體間濃度對應關系，繪制替代標準曲線及對應的線性回歸方程(圖5)，線性回歸方程為y=37.22x－13.144(R2=0.99)，y為ZEN質量濃度(ng/mL)；x為抗獨特型抗體質量濃度(μg/mL)，相關系數R2達到0.99，表明抗ZEN單抗獨特型抗體與ZEN毒素間相關度很高，可以稱為ZEN的“內影像”，因此可以用抗ZEN單抗獨特型抗體替代ZEN毒素用于無毒檢測。

圖4 ZEN(a)及Aid(b)的標準抑制曲線Fig.4 Standard curves of ZEN and anti-ZEN antibody

圖5 抗ZEN單抗獨特型抗體與ZEN標準品之間的相關性Fig.5 Correlation between anti-ZEN antibody and ZEN standard

3 討論與結論

在目前的免疫技術中，抗獨特性抗體的研制是一種可行的免疫原替代技術，國內外已經報道了很多關于抗獨特性抗體替代小分子半抗原應用于檢測的報道，如背景中提到的制備皮質醇的抗獨特型抗體并建立非競爭ELISA，國內的制備T-2毒素、大田海綿酸、黃曲霉毒素等抗獨特型抗體，用于建立無毒檢測方法[16-18]。

在制備抗獨特型抗體過程中，受到很多因素的影響，尤其是制備Ab2 β，例如免疫動物的選擇，免疫原的修飾，佐劑的選擇等[19]。本研究選擇免疫的是小鼠，這樣理論上產生的抗體應該都是抗獨特型抗體，但因免疫原性很弱，產生能夠結合抗原抗體結合部位的抗體很少，需要對免疫原即抗體進行修飾，將單抗與載體蛋白KLH偶聯，可以極大地增強單抗的免疫原性[20]。此外，利用高效免疫佐劑Quickadjuvant替代常規使用的弗氏佐劑進行免疫，該類佐劑的特點是不破壞抗原天然構像，尤其是抗原抗體結合部位，能夠最大程度的保持免疫原的活性，產生更多的Ab2 β。

本研究經過多次免疫，成功研制出抗ZEN單抗獨特型抗體(鼠多抗)，而且抗獨特性抗體與毒素ZEN間相關度很高，R2值達到0.99，因此可以作為ZEN標準品的替代品應用于ELISA檢測，為實現ZEN毒素的無毒檢測方法的建立奠定基礎。

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