不同處理條件小黑豆乳清蛋白的抗腫瘤作用

王 菲，王常青*，樊 迎，于書佳，原 敏，連偉帥

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

黑豆為豆科植物大豆(Glycine max(L.) merr)的黑色種子[1]，黑豆主要分布在我國“三北”地區，約占全國大豆栽培面積的8%左右。黑豆按顆粒大小分為大粒種黑豆(大黑豆)和小粒種黑豆(小黑豆)。小黑豆俗稱馬料豆，蛋白質含量比其他種類的大豆約高10%，達50%左右[2]，不但是一種營養豐富的高蛋白食材，而且從中醫角度來講有補腎強身、解毒益肝、壯筋骨、抗衰老之功效[3]。研究表明，在小黑豆蛋白中，乳清蛋白為8%～10%，其含量和分子質量分布與其他大豆略有不同。小黑豆乳清蛋白中的主要成分是胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)，TI被普遍認為是抗營養因子，可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低蛋白質的消化和吸收利用，同時TI還可作用于胰腺，造成胰腺肥大。有研究認為，低濃度的TI可以降低癌癥發病率[1]，但本實驗前期發現，含TI 68%的乳清蛋白在低于1.5g/kg攝入劑量時，并不能體現顯著的抗腫瘤效果；而高于3g/kg劑量時抗腫瘤效果較好，但會造成動物胰腺腫大。所以，本實驗研究不同溫度熱處理小黑豆乳清蛋白，以求得在保持一定的抗癌活性的同時，降低其抗營養性。實驗還比較不同溫度處理的小黑豆乳清蛋白的抗腫瘤作用及其對免疫功能的影響，以研究和探討小黑豆乳清蛋白處理方法與抗腫瘤效果之間的關系，為小黑豆乳清蛋白功能食品的開發提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

實驗所用小黑豆由山西省靜樂縣農業局提供；S180腹水瘤由山西省腫瘤醫院提供；綿羊紅細(SRBC)和豚鼠血清由山西醫科大學免疫實驗室提供；SPF級昆明小鼠，雄性，4周齡，體質量18～22g，山西醫科大學動物中心提供。

2,4-二硝基氯苯(DNCB) 天津市光復精細化工研究所；注射用環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯胺鹽酸鹽(BAPNA) 上海藍季科技發展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Sephadex凝膠色譜系統、UVD-680-3紫外檢測儀上海金達生物科技有限公司；SP-2012UVPC紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；低溫高速離心機 上海蘭亭設備有限公司；勻漿器 上海博通經貿有限公司；光學顯微鏡 上海彼愛姆光學儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小黑豆乳清蛋白的制備與處理

將脫脂小黑豆粉與水按質量比1:10混合，用NaOH調pH8.5，55℃提取1h，離心取上清；沉淀物以前述工藝提取2次，合并上清液，并調pH4.3沉淀去除球蛋白，得到小黑豆乳清蛋白濾液。該濾液經高真空濃縮后，分為兩部分，并分別在65℃和75℃微波加熱10min，得到抗腫瘤實驗所用的65℃處理蛋白和75℃處理蛋白。經凝膠色譜分析乳清蛋白，得知其中胰蛋白酶抑制劑Kunitz和Bowman-Birk二者占乳清總蛋白的68%。

1.3.2 小黑豆中TI活性降低率的測定

采用改良的ISO 14902:2001《動物飼料——大豆制品胰蛋白酶抑制劑活性的測定》標準及文獻[4]。取10mL具塞玻璃離心管，按照以下方法加入溶液：1)標準空白：5mL BAPNA溶液，3mL去離子水，1mL 5.3mol/L醋酸；2)標準溶液：5mL BAPNA 溶液，3mL去離子水；3)樣品空白：5mL BAPNA 溶液，1mL樣品稀釋液，2mL去離子水，1mL 5.3mol/L醋酸；4)樣品溶液：5mL BAPNA溶液，1mL樣品稀釋液，2mL去離子水。充分混勻，于37℃水浴鍋中保溫10min。然后各管均加入1mL胰蛋白酶工作液，混勻，繼續保溫10min±5s，于2)管和4)管中分別加入1mL 5.3mol/L醋酸終止反應。充分混合上述溶液，用分光光度計在波長410nm處測定溶液吸光度(用標準空白調零)。該溶液能夠至少2h保持穩定。

加熱處理后，乳清蛋白中TI活性降低率的計算方法[5]為：

式中：ΔA1是加熱處理后的乳清測得的吸光度與酶液的吸光度之差；ΔA2是原小黑豆乳清液測得的吸光度與酶液的吸光度之差。

1.3.3 S180腫瘤小鼠模型的建立

在無菌條件下抽取腹腔保種10d的小鼠S180細胞，用生理鹽水調整細胞濃度為3.0×107個/mL。除基礎組外，每只小鼠右腋皮下接種0.2mL腫瘤細胞懸液。

1.3.4 動物分組及實驗過程

動物接種S180腫瘤后24h，隨機分為基礎組、腫瘤模型組、環磷酰胺陽性對照組，65℃和75℃蛋白高、低劑量組共7組，每組10只小鼠。各高、低劑量蛋白組分別按10、3g/(kg·d)喂食(以乳清中的蛋白的質量/體質量計)，陽性對照組腹腔注射環磷酰胺20mg/(kg·d)。實驗期為14d。實驗第9天，用DNCB致敏各組動物(除基礎組)；第10天，對各組動物進行SRBC血清溶血素實驗。14d實驗結束后，測定小鼠瘤徑、白細胞數量、免疫器官指數、耳腫脹度和血清半數溶血值等生化指標。

1.3.5 免疫器官指數及白細胞數測定

各組動物連續給藥14d后24h，稱體質量并測量腫瘤直徑，眼眶取血計數白細胞總數。之后處死動物，剝離腫瘤、胸腺、脾臟等組織，用濾紙吸干后稱其質量，計算抑瘤率、瘤與體質量比和各臟器指數[6]。

式中：d1、d2、d3為腫瘤3個互相垂直的直徑/mm。

1.3.6 細胞免疫-遲發型免疫變態反應實驗[7]

實驗第9天，除基礎組外各組小鼠用脫毛劑脫毛腹部皮膚，面積約3cm×3cm，用1% DNCB溶液50μL均勻涂抹于脫毛處致敏。第14天用1% DNCB溶液10μL攻擊小鼠右耳。基礎組同樣涂耳，攻擊24h后，頸椎脫臼處死，剪下左右耳殼，用R8mm打孔器取耳片稱質量，以左右耳片質量之差為腫脹度。

1.3.7 體液免疫-血清溶血素實驗[8]

參照文獻[8]中方法制備綿羊紅細胞(SRBC)和補體制備。實驗第10天，用生理鹽水將壓積SRBC配成2%的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進行免疫。

第14天實驗結束后24h，摘眼球取血，收集血清。每份血清用生理鹽水稀釋200倍，取稀釋血清1mL置試管內，依次加入10% SRBC 0.5mL、10%補體1mL，另設不加血清的空白對照管(血清用生理鹽水代替)。混合后37℃恒溫箱保溫30min，置冰浴中終止反應。2000r/min離心取上清液1mL，加都氏試劑3mL；同時取10% SRBC 0.25mL，加都氏試劑至4mL與另一試管內(該管測定的OD值即為SRBC半數溶血值)，充分混勻，放置10min后，于波長540nm處以空白對照管調零，分別測定各管光密度值。按式(8)計算各實驗組半數溶血值HC50。

1.3.8 統計分析

實驗數據均采用±s表示，用SPSS軟件對結果進行方差分析和檢驗。

2 結果與分析

2.1 加熱對小黑豆乳清中TI活性的影響

小黑豆乳清蛋白經65℃、10min微波處理后，TI活力降低率為30.2%；經75℃、10min微波處理后，小黑豆TI活力降低率為55.0%。由此可見，小黑豆乳清蛋白經65℃和75℃處理，TI均有所下降，且前者小于后者。

2.2 小黑豆乳清蛋白對S180腫瘤的抑制作用

表1 小黑豆乳清蛋白對S180腫瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

表1 小黑豆乳清蛋白對S180腫瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

注：a.與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；b.與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)； c.與65℃同劑量蛋白組相比差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別 平均瘤直徑/mm 瘤與體質量的比/% 抑瘤率/%模型組 1.81±0.14 4.52±0.68陽性對照組 1.57±0.11b 2.13±0.91b 72.9 65℃蛋白高劑量組 1.56±0.04b 2.67±0.66b 35.8 65℃蛋白低劑量組 1.69±0.08a 3.82±1.02a 14.3 75℃蛋白高劑量組 1.46±0.03b 2.08±0.71bc 41.8 75℃蛋白低劑量組 1.53±0.06bc 2.93±0.88bc 20.5

由表1可見，與模型組相比，對于平均瘤徑和瘤與體質量比兩項指標來說，陽性對照組、75℃蛋白高、低劑量組和65℃蛋白高劑量組降低極顯著(P＜0.01)；65℃蛋白低劑量組降低顯著(P＜0.05)。各組抑瘤率順序為：陽性對照組＞75℃蛋白高劑量＞65℃蛋白高劑量＞75℃蛋白低劑量＞65℃蛋白低劑量組。比較75℃和65℃同劑量蛋白組可見，在相同攝入劑量時，前者的瘤與體質量比明顯低于后者(P＜0.05)。

2.3 小黑豆乳清蛋白對臟器指數的影響

由表2可見，各實驗組胰臟指數無統計學差異(P＞0.05)，說明經65℃和75℃處理的小黑豆乳清蛋白對小鼠胰腺無明顯影響，無致胰腺腫大作用。基礎組的肝臟指數顯著低于模型組和各實驗組(P＜0.05)，說明腫瘤移植會使小鼠的肝臟指數增加。胸腺和脾臟是機體的重要免疫器官，其結構的正常與否直接影響機體的免疫功能。與模型組相比，陽性對照組的脾臟指數、胸腺指數降低極顯著(P＜0.01)，說明環磷酰胺對小鼠這兩個免疫器官有明顯的抑制作用。而75℃蛋白高、低劑量兩組的胸腺指數與其他各組相比明顯提高(P＜0.05)，與基礎組處于同一水平。說明75℃處理組對荷瘤小鼠的免疫器官有明顯促進作用，其效果好于65℃處理組。

表2 小黑豆乳清蛋白對小鼠臟器指數的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

表2 小黑豆乳清蛋白對小鼠臟器指數的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

肝臟指數/(mg/g)基礎組 7.42±1.79 0.98±0.32a 12.93±1.01 49.19±5.70a模型組 6.23±0.51 0.70±0.10 13.27±0.82 52.48±1.89陽性對照組 4.43±0.43b 0.45±0.03b 12.88±1.16 50.23±5.51 65℃蛋白高劑量組 6.97±1.43 0.82±0.16 12.90±0.61 53.68±0.40 65℃蛋白低劑量組 6.77±1.44 0.71±0.08 13.00±0.76 52.23±0.93 75℃蛋白高劑量組 7.96±1.84 1.08±0.04a 12.76±0.84 50.91±2.35 75℃蛋白低劑量組 6.82±0.59 0.93±0.20a 12.92±0.56 50.91±2.35組別 脾臟指數/(mg/g)胸腺指數/(mg/g)胰臟指數/(mg/g)

2.4 小黑豆乳清蛋白對免疫細胞及免疫功能的影響

表3 小黑豆乳清蛋白對小鼠免疫細胞及免疫功能的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

表3 小黑豆乳清蛋白對小鼠免疫細胞及免疫功能的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

(106個/mL) 腫脹度/% 半數溶血值HC50基礎組 12.4±3.3b 19.5±2.67b 119.74±5.54b模型組 5.15±1.78 16.73±0.88 99.87±3.77陽性對照組 6.00±2.16 18.26±1.14b 119.20±2.95b 65℃蛋白高劑量組 9.67±0.58b 17.15±0.99a 113.04±5.59b 65℃蛋白低劑量組 7.12±1.32a 17.06±0.91a 109.27±2.76b 75℃蛋白高劑量組 13.50±1.11bc 19.43±0.49bc 121.18±5.43bc 75℃蛋白低劑量組 9.07±0.81bc 18.97±1.77bc 115.87±7.93bc組別 白細胞數/

由表3可見，各實驗組血清溶血素值都比模型組極顯著提高(P＜0.01)；模型組的白細胞數、腫脹度和半數溶血值都顯著低于基礎組(P＜0.01)，免疫損傷最大。75℃蛋白高劑量組的白細胞數等3項免疫指標與基礎組處于同一水平，免疫調節效果最好。與模型組比，陽性對照組小鼠的白細胞無顯著增加(P＞0.05)，65℃蛋白高、低劑量組顯著升高(P＜0.05)，75℃各實驗組升高極顯著(P＜0.01)。陽性對照組和75℃蛋白高、低劑量組小鼠的耳殼腫脹度與模型組相比增加極顯著(P＜0.01)，65℃蛋白高、低劑量組的腫脹度增加顯著(P＜0.05)，說明各實驗組對細胞免疫功能下降有顯著抑制作用。75℃和65℃同劑量蛋白組對比，白細胞數、耳殼腫脹度和血清半數溶血值3個指標均存在顯著差異(P＜0.05)，反映在小鼠的非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫方面，均為75℃處理組優于65℃處理組。

3 討 論

有研究認為，TI有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質消化吸收等抗營養作用，并可致胰腺腫大或引發炎癥，但低濃度的TI具有降低癌癥發病率的作用[9-10]。一般認為，當一種受試物使腫瘤小鼠的抑瘤率達到30%以上時，表明該受試物可以有效抑制腫瘤生長[11]。但是本實驗前期發現，含TI 68%的小黑豆乳清蛋白如果不經熱處理，在低于1.5g/kg攝入劑量時的抗腫瘤效果不顯著；高于3g/kg劑量時抗腫瘤效果雖好，但會致動物胰腺腫大。因此，本實驗對含TI 68%的小黑豆乳清蛋白75℃和65℃處理后，以3g/(kg·d)和10g/(kg·d)的劑量喂食小鼠，結果表明，小黑豆乳清蛋白在75℃和65℃處理后，TI活力分別降低了55.0%和30.2%，TI抗營養性降低了，喂食小鼠后胰臟指數與基礎組相比無明顯差異；同時發現，相同劑量條件下，所有75℃蛋白處理組的抑瘤率均優于65℃蛋白組，75℃和65℃處理組的S180抑瘤率分別為41.8%、35.8%。因此，從降低抗營養性和保持TI的較高抗腫瘤活性的角度看，用75℃處理乳清蛋白效果較好，而該溫度處理后抗腫瘤效果優于65℃處理的原因可能是，75℃處理使乳清蛋白中TI的構型改變適度，使具有增強免疫或抗腫瘤活性基團的外展比65℃處理更充分[12]。

本實驗發現，腫瘤移植會使小鼠的肝臟指數增加，可能是腫瘤細胞的繁殖對肝臟產生損傷，導致肝臟細胞代償性增生同時伴隨肥大[13]，從而使小鼠肝臟質量增加。胸腺、脾臟是重要的免疫器官，實驗發現，75℃蛋白組的胸腺指數與65℃蛋白組及模型組相比明顯提高，這可能與小黑豆乳清蛋白在75℃處理后抗氧化能力提高及對機體的保護性提高有關。而各實驗溫度和劑量的蛋白組動物的脾臟指數與基礎組相比無顯著差異，說明小黑豆乳清蛋白對小鼠免疫器官無明顯抑制作用。而環磷酰胺陽性組小鼠的胸腺和脾臟器官都受到顯著的抑制。在相同劑量時，75℃處理組抑制荷瘤小鼠各項免疫功能下降的作用也明顯好于65℃處理，且呈一定的量效關系，與抑瘤率的實驗結果相對應，因此小黑豆乳清蛋白抗腫瘤作用可能是通過增強免疫細胞、免疫分子對腫瘤細胞的殺傷能力并防止腫瘤的擴散和轉移，調動和增強動物抗腫瘤免疫活性；或者是通過增強機體的非特異性免疫能力，起到間接抑制S180腫瘤細胞生長的作用。至于熱處理溫度對乳清蛋白分子結構的變化及作用機理還有待進一步研究。

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