利用多菌種生產傳統發酵食品研究進展

陳 楠，戴傳云*

(重慶科技學院化學化工學院，重慶 401331)

中國傳統發酵食品生產歷史悠久，風味獨特，深受人們喜愛。傳統發酵食品包括白酒、發酵乳制品、發酵調味制品、發酵蔬菜制品及發酵肉制品等，這些都是我國食品工業的重要組成部分。傳統發酵食品獨特的風味及品質與其復雜的微生物群落關系密切，如：白酒繁雜的風味與酒曲、酒醅、窖泥中的微生物菌群密不可分；腌漬蔬菜在乳酸菌作用下產生酸爽口感；腌制肉制品色澤和質構的穩定離不開乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等微生物。近年來研究發現，除原料本身的生物活性物質外，傳統發酵食品還能在微生物和酶的作用下產生多糖、生物活性肽、維生素等功能因子[1]，具有較高的營養保健價值，開發潛力巨大。但傳統發酵食品生產中普遍存在工業化程度低、產品品質不均一及不良微生物污染等問題，制約了傳統發酵食品的發展。利用多菌種在生產過程中形成優勢菌群，調控代謝，能提高產品品質和生產效率，是實現傳統發酵食品工業化生產的有力手段。本文將綜述多菌種生產傳統發酵食品的現狀及存在的問題，并提出解決措施。

1 多菌種發酵在國內外傳統發酵食品生產中的應用

在傳統發酵食品生產中的組合使用，多菌種發酵在傳統發酵食品生產中應用廣泛[2]。國內外研究者在多菌種發酵食品的工藝、微生物作用機理、風味形成及發酵劑制備等方面進行了多項研究，如日本繼承和發揚了多菌種醬油釀造技術，已成為醬油生產強國；韓國利用乳酸菌發酵蔬菜已實現了工業化[3]；歐洲和北美洲是商業化發酵劑的主要生產地(表1)。我國傳統發酵食品主要利用多菌種或多菌種與酶的混合制劑生產，菌種從產品及生產環境中分離純化，主要為乳酸菌等細菌及酵母、霉菌等真菌(表2)。

表1 商品化食品發酵劑供應商及產品Table 1 Commercial suppliers of food fermentation starters

從我國古老的大曲釀酒到目前各種冷凍干燥發酵劑

表2 我國傳統發酵食品主要接種微生物及其發酵方式Table 2 Main starter strains and fermentation styles of traditionally fermented foods in China

多菌種發酵可提高原料利用率、縮短加工周期，提高生產效率。沈國華[13]利用多種乳酸菌發酵蔬菜并對溫度進行控制，發現接種后發酵速度比自然發酵提高3倍。李正國[14]研發的榨菜人工發酵劑可將榨菜生產周期由90d縮短至45d。趙麗華等[15]利用復合發酵劑及戊糖片球菌生產羊肉香腸，結果表明多菌種發酵羊肉香腸的咀嚼性、膠黏性高于對照組，復合發酵劑接種后先于對照組形成優勢菌群，其次生代謝物與原料中蛋白質、脂肪等物質作用加速風味和質構形成。翟瑋瑋[16]利用根酶、米曲霉、黑曲霉分別制曲混合發酵生產醬油，提高了蛋白酶活力和原料利用率，產品中總氮、氨基酸態氮含量增加，在后熟期添加乳酸菌和酵母菌，能改善醬油風味。

利用多菌種發酵可改善產品營養品質。發酵乳制品采用不同乳酸菌進行組合發酵，可減少生產中噬菌體污染，生產出不同益生特性、酸度、黏性的產品，如雙聯或三聯益生菌組合發酵的乳制品能改善人體腸道菌群，增強免疫能力[17]。Minervini等[18]篩選出Streptococcusthermophilus、Lactobacilluscasei兩種乳酸菌發酵羊乳，產品中益生菌的數量大于107CFU/g，并產生了血管緊張素轉化酶(ACE-I)抑制肽、γ-氨基丁酸(GABA)兩種生物活性物質，為開發功能性發酵羊乳提供了新思路。Mollet[19]利用敲出ldhD基因的乳酸菌LactobacillusjohnsoniiLa1發酵牛乳，該乳酸菌僅代謝產生可消化的L-乳糖，不產生D-乳糖，使得發酵牛乳制品的消化利用率得到了提高。Plaude等[20]用Streptococcus thermophilus、Lactobacillushelveticu和Bifidobacterium longum三種益生菌純種接種、混合接種生產醬油，醬油中大豆異黃酮及B族維生素含量較對照組均有提高。

多菌種發酵食品的品質與菌種的組合方式、接種量、發酵時間、溫度等因素關系密切。Kourkoutas等[21]采用冷凍干燥方法制備了克菲爾發酵劑，并用于生產弗塔型干酪。實驗考察了發酵劑添加量、不同生產工藝條件等因素對弗塔型干酪感官品質的影響，并利用固相微萃取-氣相-質譜法(SPME-GC-MS)方法對發酵劑生產的干酪香味成分進行了系統分析，結果表明，發酵劑接種量對產品品質影響顯著，克菲爾發酵劑接種量為1g/L、氯化鈉含量為7%時生產的干酪具有更好的風味及更長的貨架期。

發酵食品中生物胺、亞硝酸鹽的含量等被認為是影響其安全性的因素之一。接種合適的菌種可對產品中生物胺、亞硝酸鹽含量進行控制。Mohamed等[22]接種Lactobacillusplantarum2142、Lactobacillus caseisubsp.casei2763 和Lactobacillus curvatus2771控制德國泡菜中生物胺含量，結果證實接種上述乳酸菌能明顯抑制游離氨基酸生成從而降低組胺、腐胺等生物胺含量。類似的結果也出現在多菌種生產的發酵肉類制品中，如Muhammad等[23]接種Staphylococcus carnosusFS19 和Bacillus amyloliquefaciensFS05發酵魚肉香腸，120d后實驗組中生物胺總量比對照組分別降低15.9% 和12.5%。Yan Pingmei等[24]篩選出Lb.pentosus和Leu.Mesenteroides作為泡菜發酵菌種，進行發酵實驗，結果顯示發酵劑能抑制硝酸鹽還原細菌Enterobacteria的增殖，這解釋了乳酸菌發酵劑能降低腌漬蔬菜亞硝酸鹽含量的原因。乳酸菌在發酵過程中還能產生乳酸細菌素，抑制腐敗菌的生長，被認為是天然安全的防腐劑[25]。Tolonena等[26]利用多種乳酸菌發酵生產泡菜，發現產品中均含有不同量的乳鏈菌肽(Nisin)，能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄糖球菌、沙門氏桿菌等增殖，具有廣譜抗菌性，可提高發酵食品安全性。

2 利用多菌種生產我國傳統發酵食品存在的問題

2.1 傳統發酵食品微生物生態學研究薄弱

利用多菌種生產傳統發酵食品，須首先掌握其微生物群落組成及動力學特征。傳統發酵食品微生物群落結構復雜，而對此開展的生態學研究尚處于起步階段，對傳統發酵食品中微生物群落組成、微生物群落與環境的相互作用、微生物群落功能的研究尚不深入，特別是少數民族傳統發酵食品，因地域性強，對其微生物群落結構和功能的研究則更少。這些方面，基礎研究的薄弱限制了多菌種聯合發酵在生產中的應用。

2.2 優良菌種的選育及改良不足

多菌種發酵應用的難點在于缺乏高性能菌種，因此篩選和改良菌種的功能也是需要解決的問題之一。我國傳統發酵食品中部分微生物生境特殊(高鹽、酸性、乙醇、煙熏等)，導致其代謝途徑特異，能產生具有生物學活性的次生代謝物，優良微生物資源十分豐富，而目前對這種資源的發掘不足。一方面，當前所用菌種主要通過自然篩選方法從產品或生產環境中獲得，這種篩選途徑效率低，篩選到適合于生產的優良發酵菌種難度大；另一方面，篩選菌種的基因組學、蛋白質組學、代謝組學、遺傳特性及食品加工性能等基礎研究薄弱，缺乏對野生型菌種功能和性狀的定向改良，在生產中易發生性能衰退及自然變異，不利于發酵產品品質標準化和均一化。

2.3 多菌種發酵可能對傳統發酵食品風味和品質產生負面影響

利用多菌種生產傳統發酵食品能提高生產效率、確保產品品質均一，但也可能影響產品風味和品質。接種多菌種可能改變傳統發酵食品微生物群落結構；多菌種的接種方式、發酵時間、接種量、菌種配比等不當也會對產品的品質產生不良影響，如果多菌種發酵降低甚至喪失了傳統發酵食品的原有風味特色，那么這種工藝革新便失去了意義。目前傳統發酵食品中各風味物質的平衡、功能物質的形成與微生物群落的關系尚未全部闡明，接種多菌種對發酵食品優勢菌群的影響、發酵代謝的調控等問題也需要深入研究。如何在利用多菌種提高生產效率與保持傳統發酵食品優良特性間找到平衡，也是多菌種生產傳統發酵食品面臨的挑戰。

2.4 發酵菌種安全性

發酵菌種的安全隱患主要來自四個方面：菌種的致病性；菌種產生的次生代謝物、抗生素、激素等物質對人的潛在危害；基因工程技術改良菌種的生物安全問題及生產過程中不良微生物的二次污染。這些問題與傳統發酵食品生產工藝及微生物的特性相關，為多菌種發酵在傳統發酵食品中的應用帶來一定的安全隱患。另外，隨著益生菌資源的開發，越來越多的國外益生菌申請進入國內市場，這些益生菌能否分享傳統發酵菌種的安全性，益生菌在傳統發酵食品中應用的安全風險如何進行評估等也是需要解決的問題之一。

2.5 商業化發酵劑的缺乏

優良的商業化發酵劑是實現傳統發酵食品生產工業化、標準化的必要條件。目前我國缺乏能滿足不同特征產品生產所需的商業化發酵劑。就乳酸菌發酵劑而言，我國多數發酵乳制品企業靠進口國外冷凍干燥乳酸菌發酵劑[25]。國內還沒有供發酵蔬菜制品、發酵肉制品、發酵豆類制品等食品生產的專門商業化發酵劑。除菌種因素外，發酵劑制備中的關鍵技術問題(如菌種的擴大培養、高效菌體保護劑的篩選、菌粉的冷凍干燥及保藏、凍干菌粉復水性等)尚未解決，阻礙了發酵劑的開發和生產，造成商業化發酵劑缺乏。

3 對應的解決措施

針對多菌種發酵在傳統發酵食品生產中出現的問題，提出以下解決措施：

3.1 開展傳統發酵食品微生物生態學研究

利用宏基因組學(metagenomic)、宏蛋白質組學(metaproteomic)技術開展傳統發酵食品微生物生態學研究。近年來興起的宏基因組學，可通過提取環境中所有微生物的DNA，對其進行序列和功能分析，從而反映環境中微生物群落結構及遺傳多樣性[27]，該技術包括DNA提取純化、宏基因組文庫構建及目標克隆子篩選等步驟，用于研究傳統發酵食品微生物能更準確地掌握其菌群多樣性及結構組成，避免了傳統分離培養方法所得微生物群落信息不全面的缺點，同時也可對發酵過程中的優勢菌、功能菌和功能性酶類進行篩選，目前已有研究者開始對中國大曲酒微生物宏基因組進行研究[28]。在發酵食品微生物宏基因組數據不斷積累的基礎上，可進一步利用宏蛋白質組學把微生物群落組成與其功能聯系起來，研究不同時間、不同空間中基因的表達，掌握菌群落動態變化過程，分析發酵食品中微生物群落的功能及微生物群落與環境間的相互作用。利用這些研究結果建立相應信息數據庫，為多菌種聯合發酵在傳統發酵食品生產中應用提供理論依據。

3.2 建立傳統發酵食品菌種資源庫，合理利用新技術改良發酵菌種

對我國傳統發酵食品中優良菌種進行收集和開發，逐步建立傳統發酵食品菌種資源庫，為篩選和改良發酵菌種提供資源。同時對生產中使用菌種的基因組學、蛋白質組學、代謝組學等生物學信息進行研究，為菌種的定向改良奠定基礎。隨著分子生物學技術的發展，發酵菌種選育也由自然篩選發展到對菌種的設計和改良，如利用重組工程技術改良乳酸菌，使其表達重要蛋白(如風味酶、轉運蛋白、防腐劑、調節蛋白等)以及通過調控細胞內關鍵酶活性，促進目標代謝物表達，使其更適應于工業生產[29-31]。應利用原生質融合、基因工程、空間誘變育種等新技術定向選育出更多的適合我國傳統發酵食品生產，具有自主知識產權的發酵菌種。

3.3 利用傳統發酵食品風味、功能物質形成原理指導多菌種在生產中的應用

傳統發酵食品風味形成與原料、生產環境、生產工藝、微生物的活動密不可分。微生物代謝的酶類將原料中的蛋白質、糖類、脂肪等分解成氨基酸、寡糖為其生長提供營養，同時也形成風味物質的前體，而代謝生成的乙醇、乙醛、乳酸、丁酸乙酯等則直接形成產品的風味。多菌種生產傳統發酵食品，應明確各產品風味物質的主體成分及形成機理。利用食品風味化學分析新技術如氣相色譜-質譜、氣相色譜-吸聞技術、電子鼻技術[32]等加強對傳統發酵食品的特征風味的分析研究，構建傳統發酵食品的特征風味指紋圖譜，與感官評價相結合，指導菌種選擇和組合配比；功能性物質的積累應利用基因組學研究方法從基因水平闡述微生物代謝與傳統發酵食品功能物質積累的關系，指導多菌種發酵對功能物質積累的調控，使其達到傳統發酵食品風味和品質的要求。

3.4 加強菌種安全性評價

最大程度降低食品工業用菌種的安全風險，需要加強對菌種的食用歷史、菌種與寄主的相互作用，菌種在胃腸道的定殖性、轉移性、繁殖性等進行研究。對于基因工程改造菌種應進行嚴格的安全評價。在生產過程中，傳統發酵食品生產企業應按危害分析和關鍵控制點(HACCP)實施指南進行管理，提高發酵食品安全衛生標準，防止生產中有害菌二次污染污染。

3.5 開發直投式發酵劑

直投式發酵劑無需進行活化、擴培等預處理，可省去菌種車間，簡化生產工藝，使生產規范化[33]，在傳統發酵食品生產中具有很好的應用前景。對直投式發酵劑制備中的科學問題進行研究，利用透析培養、耦合發酵、代謝調控等技術手段改進菌種高密度培養技術；在細胞和分子水平上研究冷凍干燥過程中保護劑對微生物細胞的保護機制，設計高效保護劑，提高直投式發酵劑菌種存活率，保護其發酵性能；利用冷凍干燥、真空噴霧干燥等技術開發單一或復合菌種，便于組合出適合不同產品生產需要的多菌種發酵配方，滿足各生產需要。

4 結 語

我國傳統發酵食品是勞動人民生產生活中的智慧結晶[34]，是我國寶貴的文化遺產，也是重要的食品資源，應著力推進傳統發酵食品工業化進程，使其更具有市場競爭力。傳統發酵食品市場廣闊，發展潛力巨大，利用多菌種組合發酵的優勢，對傳統發酵食品生產工藝進行革新并解決多菌種發酵生產傳統食品過程中的問題，對繼承和發展傳統發酵食品，促進行業健康發展有重要意義。

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