沙門氏菌快速檢測技術研究進展

章偉帆

（泉州市產品質量檢驗所，福建 泉州 362000）

沙門氏菌是一類革蘭氏陰性菌，其廣泛分布于自然界，是常見的人畜共患型致病菌。沙門氏菌對外界的抵抗力較強，耐膽鹽，對營養需求不高。目前，已知沙門氏菌就將近2213種，而且幾乎所有的沙門氏菌都能引起嚴重的食物中毒事件，是導致食物中毒的主要病原菌，對人類健康安全造成重大威脅。在美國，每年有650萬～3300萬人發生食物中毒，近5000人因此而喪生［1］。為此，美國政府每年需要花費近50億～60億美元［2］。在中國，沙門氏菌同樣嚴重危害著我國的食品安全。據相關數據表明，我國每年因沙門氏菌而導致的食物中毒事件占所有食物中毒事件的40%～60%。所以，建立一種快速有效的檢測手段是減少食物中毒事件的重要手段。但是由于沙門氏菌的血清型過于繁多，傳統的檢測方法又需要經過預增菌、選擇性曾菌、分離培養、生化鑒定及血清學分型鑒定5個步驟。繁雜的生化反應使得檢測過程十分復雜，耗時耗力，至少需要4～7天才能得到精確的檢測結果。因此，尋找一種快速、有效、準確、簡便的檢測技術成為國內外學者研究的方向。下面就近年來對于沙門氏菌新的檢測技術做一個簡單的介紹。

1 免疫學檢測方法

在所有檢測食品中的沙門氏菌的技術手段中，免疫學檢測技術占有重要的地位，主要是因為其價格低廉，不需要特定的實驗儀器，容易在基層推廣開來。其基本原理就是利用抗原抗體之間的特異性結合而到達檢測目的。

1.1 酶聯免疫吸附試驗 （ELISA）

酶聯免疫吸附試驗 （ELISA）的基本原理是將抗原或者抗體先固定在某種固相載體上，然后加入酶標抗原或者抗體和受檢樣品，與固相載體上的抗原或者抗體發生特異性結合，從而形成抗原抗體復合物。將固相載體上多余的反應液清除后，加入酶反應底物，使得反應底物被固相載體上的酶所催化，產生有色物質，最后通過測量有色物質的含量來分析樣品中待測物質的含量［3］。

1977年，Krysinski和Heimsch利用沙門氏菌鞭毛抗體，首次將ELISA方法應用于食品檢測［4］。最初ELISA方法雖然能在48h內快速檢測出沙門氏菌，但是由于所使用的多價抗血清在不同程度上存在交叉反應，使得最初用ELISA檢測方法所得到的檢測結果假陽性很高，而且靈敏度為105cfu/mL。隨著單克隆抗體技術的產生，Robinson等［5］建立了直接ELISA檢測方法，該檢測方法大大降低了因交叉反應而出現的假陽性現象，顯示出單抗的卓越性能。在我國，焦新安等［6］利用單抗技術獲取了具有沙門氏菌廣譜結合特性的4種單克隆抗體，其中2種反應互補，對已檢沙門氏菌的覆蓋率高達99%，而且并沒有與受檢大腸桿菌發生交叉反應；黎兆滾等［7］利用ELISA技術檢測94份魚粉樣品中的沙門氏菌，所得的結果中陰性符合率為100%，陽性符合率為92%，總符合率為98%；另外，文其乙等［8］利用沙門氏菌特異性單抗de7和CB8形成了快速檢測試劑盒，對500份蛋品進行ELISA檢測，檢測結果可靠，陽性率比國際標準方法高。

1.2 免疫磁珠分離技術 （IMS）

免疫磁珠分離技術法 （IMS）技術的原理是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面，在外加磁場的作用下與受檢樣品中的靶細胞特異性結合，使得靶細胞能夠富集、分離。近年來，研究人員利用免疫磁珠來富集沙門氏菌，從而使得檢測更加快捷。1996年，Mansfield和Forsythe比較了選擇性培養基富集法和免疫磁珠捕捉法富集對120種食物進行沙門氏菌的富集和分離。結果表明免疫磁珠捕捉法富集效果和選擇性培養基富集的效果相同［9］。IMS檢測技術雖然在特異性方面具有很大的優勢，但是靈敏度不足，所以近年來IMS技術都是與ELISA、PCR、Taqman PCR技術相結合，形成IMSELISA、IMS－PCR、IMS－TaqmanPCR技術，這樣就大幅度的增加了檢測的靈敏度，提高檢測的準確率。

Kofitsyo等［10］利用免疫磁珠富集分離技術與酶聯免疫吸附試驗相結合，即IMS－ELISA技術檢測食品中的沙門氏菌，包括前期的樣品處理，整個檢測過程只花費了26h，檢測最低限為105cfu/mL；2008年Virve等利用免疫磁珠富集分離技術與熒光定量PCR相結合，即IMS－Taqman PCR技術，對食品中的沙門氏菌進行檢測，包括樣品處理的6h，整個流程只需要8h，而且靈敏度、準確度、特異性分別為98.4%、99.1%、100.0%［11］；2009年，Mercanoglu等［12］利用免疫磁珠富集分離技術與PCR技術有效的結合，建立快速有效檢測沙門氏菌的IMS－PCR方法，對牛奶中的沙門氏菌進行檢測只需要14h，而且檢測的靈敏度達到1～10cfu/mL。

2 分子生物學技術檢測

分子生物學檢測方法是近年來發展最為迅速的食品檢測手段之一，由于其具有簡便快捷，特異性強，準確性高等優點，使得它在食品安全檢測上表現出很大的優越性。

2.1 聚合酶鏈式反應技術 （PCR技術）

聚合酶鏈式反應技術 （PCR）是近年來發展較快的一項檢測技術，它具有簡便，快捷，特異性強以及靈敏度高等特點，現已廣泛應用于食品安全檢測。PCR技術檢測沙門氏菌的基本原理很簡單，就是通過設計特異性引物，擴增沙門氏菌中保守性高的核酸序列，根據實驗結果分析受檢樣品中是否含有沙門氏菌，所以PCR技術的關鍵在于靶序列的選擇和引物的設計。

近年來對于PCR檢測技術的報道很多。invA基因是決定沙門氏菌的侵染力的，所編碼的蛋白普遍存在于沙門氏菌表面，其序列具有高度的保守性［13］。Rahn等［14］利用沙門氏菌的invA基因作為靶序列，對630種沙門氏菌和142種非沙門氏菌進行檢測，結果表明在非沙門氏菌中沒有一個菌種擴增出目的條帶，在630種沙門氏菌中除了4個菌種外，其余菌種均擴增出目的條帶；在歐洲，由4個歐洲實驗室聯合對435個天然樣品進行檢測，結果表明用invA基因作為靶序列進行檢測的特異性和準確性高達97.5%［15］。

在國內，我國研究人員也報道了許多有關該技術的文章。黃金林等［16］開發設計了沙門氏菌中高度保守的組氨酸轉運操縱子基因序列的引物，并對15株沙門氏菌標準菌株，10株非沙門氏菌菌株以及27株現場分離的沙門氏菌菌株進行PCR擴增，結果表明所有對照菌株均未出現目的條帶，而沙門氏菌菌株皆有495bp的目的條帶，從結果可以說明所開發的這對引物對沙門氏菌的檢測表現出極高的特異性；孔繁德等［17］根據沙門氏菌基因組序列中高度保守的序列fimY基因，建立了用于檢測沙門氏菌的PCR通用方法，并用該方法對廈門地區的禽類產品進行了沙門氏菌的檢測，取得了喜人的成績；汪琦等［18］利用PCR方法快速檢測方法對全脂奶粉、生牛肉和加工過的雞肉中的沙門氏菌進行檢測，其檢測結果與傳統檢測手段檢測結果一致，檢出限為100cfu/25g，準確性達100%。

2.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR不同于常規PCR之處在于，它能夠對DNA進行定量檢測，而且敏感性達到4.5 cuf/mL，是常規PCR的100倍，特異性高，能夠避免PCR污染問題。其原理是在PCR過程中加入一個含有熒光基團標記的特異性寡核苷酸鏈探針，該探針兩端分別標記有熒光淬滅基團和熒光報告基團。在PCR過程中，熒光淬滅基團從探針上脫落，從而使得熒光報告基團發出的熒光能夠被熒光系統檢測到。根據檢測到的熒光信號對PCR過程進行實時監測，通過標準曲線對樣品進行定量分析檢測。

Seo等［19］在對雞蛋的檢測中，采用熒光定量PCR手段對D型沙門氏菌特有的sefA基因進行擴增，結果表明使用熒光定量PCR手段與常規檢測方法檢測的結果一致，而且最低檢出限僅為1cfu/600g雞蛋清洗液；Malorny等［20］在對雞蛋和禽肉樣品的沖洗液進行檢測中，用Taqman探針擴增腸道沙門氏菌所特有的Prot6e基因，發現結果與常規檢測100%一致，且最低檢出限為3cfu/50mL；我國科研人員鐘偉軍［21］等根據stn基因設計了1對特異性引物和熒光探針，stn是能夠編碼鼠傷寒沙門氏菌腸毒素的基因，他們通過摸索熒光定量PCR體系和條件，建立了一套檢驗沙門氏菌的熒光定量PCR方法。他們利用這套方法對人工污染沙門氏菌的雞蛋 （沙門氏菌初始含菌量為1cfu/g）和豬肉 （沙門氏菌初始含菌量為1cfu/g）進行檢測，結果皆為陽性，具有較強的特異性和高的敏感性。

2.3 環介導等溫擴增 （LAMP）

環介導等溫擴增技術是由 Notomi等［22］在2000年開發的一種新的核酸擴增技術。它的原理是根據靶序列上的6個特定區域設計4條引物，在65℃恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶能夠在1h內擴增出109個靶序列拷貝的核酸擴增技術。在擴增過程中，反應液中的鎂離子能夠與從核苷酸中析出的焦磷酸根離子結合，生成肉眼可見的白色沉淀——焦磷酸鎂。LAMP與常規PCR相比，其無需繁雜的電泳和紫外觀察過程，也不需要昂貴的PCR儀器，所以便于基層應用。

LAMP技術的關鍵在于關鍵區域的選擇和特異性引物的設計。研究發現invA基因在不同沙門氏菌菌株之間存在較高的同源性，而且通過Blast分析，該基因與其他物種并無同源關系，所以invA基因是沙門氏菌的一個重要的特殊區域。黃金海等［23］通過對invA基因進行引物設計，通過LAMP技術對4種非沙門氏菌和7種沙門氏菌血清型進行檢測，結果發現7種沙門氏菌皆能進行有效擴增，而4種對照菌不能擴增，這說明利用invA基因設計出的特異性引物對于檢測沙門氏菌具有極好的特異性。而且在對于食品中沙門氏菌的檢測中，樣品中最低檢限為336cfu/mL，具有很高的靈敏性。

LAMP具有特異性強，靈敏性高，操作簡便，無需儀器等優點。重要的是運用LAMP技術檢測沙門氏菌只需要2h，即使加上增菌時間，也只需15h，便于基層的推廣，具有很高的實用價值。

2.4 基因芯片 （DNA chip）

基因芯片又稱生物芯片、DNA芯片。其原理是將許多已知的DNA探針固定在玻片或者硅片上，微生物樣品DNA可以通過PCR的方法標記探針。然后將經過熒光標記的樣品分子與固定在基因芯片上的DNA探針進行雜交。用洗脫液將沒有雜交的樣品分子洗脫后，通過熒光信號的強弱來判斷樣品分子的序列信息和數量，最后利用序列信息來分析樣品中是否含有目的菌。該方法可以一次性檢測多種病原菌，而且具有特異性強，靈敏度高，快速準確等特點，在檢測沙門氏菌等致病菌中具有廣泛的應用前景。

Cremonesi等［24］利用細菌的16SrRNA基因設計探針，制成基因芯片，成功運用于微生物中病原菌的檢測；2006年，為了確認和驗證鼠傷寒沙門氏菌的致病基因，Shannon等［25］利用基因芯片，通過PCR擴增了10個目的基因，并制成熒光探針標記與DNA雜交，這些基因包括：orgA、spi4H、purR、ORF319、rmbA、misL、spi4F、spi4N、rRNA以及ttrB，最終成功的檢測到了71個致病基因，這個結果表明通過PCR擴增增加了基因芯片雜交的準確度和可信度；Wilson等［26］利用病原體致病基因和20寡核苷酸藻紅素標記探針，開發了一套可以精確識別18種真核生物、原核生物和致病性病毒的DNA微陣列。

3 檢測沙門氏菌的其他方法

除了上述所介紹的免疫學方法和分子生物學方法，近年來其他越來越多的新技術也體現出它的優越性。

3.1 生物傳感器 （Biosensor）

生物傳感器的原理是將待測樣品與儀器中的生物分子識別原件發生反應，然后通過儀器中特有的信號轉換器將反應信號轉變成可辨別的光信號或者電信號。所以，影響生物傳感器檢測的特異性和靈敏性的關鍵在于儀器中的生物分子識別原件以及信號轉換器。Pathiran等［27］使用沙門氏菌的多克隆抗體制成生物分子識別原件，制成可用于檢測沙門氏菌的生物傳感器，該傳感器反應時間小于100s，最低敏感度為102個細胞/mL。雖然生物傳感器具有自動化程度高，分析速度快，對使用者要求低等特點，但由于生物分子識別原件壽命短，生產成本高，這是阻礙該方法發展的重要原因。

3.2 熱裂解氣相色譜－質譜技術 （Py－GC－MS）

熱裂解氣相色譜—質譜技術是一種簡單、快速、靈敏度高的一種新技術，目前已經廣泛應用于微生物的鑒定和檢驗當中。郭愛玲等［28］采用Py－GC－MS技術對沙門氏菌細胞進行檢測，通過分析總離子流色譜圖，確定沙門氏菌熱裂解氣相色譜－質譜的條件與部分裂解產物的結構，從而能夠為快速鑒定沙門氏菌提供新的方法；董海燕［29］建立了一套Py－GC－MS快速檢測沙門氏菌的方法，她將4種沙門氏菌全細胞在650℃下裂解，時間為12s，離子源溫度230℃的條件下，得到了4張總離子色譜圖，確定了4種沙門氏菌裂解產物 （吲哚、苯酚、1－十三烯）的分子結構，為快速檢測沙門氏菌奠定了基礎。

3.3 電阻抗法

近年來一項新的生物技術——電阻抗法已經逐步應用于食品中微生物的檢測，而且對食品中沙門氏菌的檢測已經通過了AOAO的認可。其原理是根據不同微生物在生長和繁殖過程中，將培養基內電惰性大分子底物分解成電活性小分子產物的能力不同，從而導致電阻抗降低的程度不同。Pless等［30］用電阻抗法和傳統檢測方法對250種食品中進行沙門氏菌檢測，結果表明在122種沙門氏菌污染食品中，電阻抗法檢出了119種，而傳統檢測方法僅檢出了106種；陳廣全等［31］對21種人工加入沙門氏菌的食品進行檢測，分別用了電阻抗法和傳統檢測方法，結果電阻抗法檢測結果與傳統檢測結果一致，對于陰性結果可以在48h內得到。這說明電阻抗法能夠快速、準確地檢測出食品中的沙門氏菌。

4 小結

隨著生物學技術的發展，新的食品檢測技術層出不窮。這些技術與傳統檢測方法相比較而言，具有快速、簡便、特異性強等特點。分子生物學檢測手段雖然能夠快捷地檢測沙門氏菌，但是技術難度大，成本高，推廣難度大。而免疫學方法中ELISA應用較為普遍，隨著相關研究的不斷深入，ELISA技術在食品檢測中發揮著越來越重要的作用。總之，隨著免疫學和分子生物學的發展，相信對于食品中沙門氏菌的檢測技術將向著快捷、特異性強、靈敏度高、經濟實惠的方法不斷發展。

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