格爾德霉素對膠質瘤細胞MT1－MMP及u－PA基因表達的影響

王春輝，李蘊潛，韓雪梅

（1.吉林省人民醫院 神經外科，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院 神經外科；3.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科）

膠質瘤侵襲性生長的發生機制一直是研究的熱點，然而，迄今尚未取得突破性進展。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種多功能的細胞因子，主要通過 HGF／c－Met通路促進腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲［1，2］。格爾德霉素（geldanamycin，GDM）對HGF具有明顯的抑制作用，能夠阻斷HGF／c－Met通路。本研究擬探討GDM作用下，HGF／c－Met通路下游基因膠質瘤細胞膜型基質金屬蛋白酶－1（Membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT1－MMP）和尿激酶型纖溶酶原激活物（Urokinase－type plasminogen activator，u－PA）表達情況，旨在為深入認識其侵襲性生長的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

異硫氰酸胍（Trizol）購自上海生工工程公司，HGF購自美國Calbiochem公司，GDM購自美國Sigma公司，美國PE公司PCR擴增儀。

1.2 細胞培養及實驗分組

37℃，5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養U87和U251細胞（吉林省腫瘤研究所提供）。用終濃度為30μg／L的HGF作用24 h后，加入濃度為1 000 nmol／L的GDM處理48 h，收集細胞，Trizol法提取總RNA。實驗分為正常對照組、HGF組、GDM組和 HGF＋GDM組。

1.3 總RNA提取

將收集的細胞轉至1.5 ml EP管中，加入800 μl Trizol，混勻，室溫放置5 min；加入200μl氯仿劇烈振蕩30 s，室溫3 min；12 000 r／min，離心5 min；吸上清至另一1.5 ml EP管中，加入等體積異丙醇混勻室溫放置30 min；12 000 r／min，離心10 min；移去上清，加1 ml 75%冷乙醇（4℃）洗1～2次，4℃，8 000 r／min，離心5 min，棄上清，適中干燥，50 μl DEPC水重懸，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1.4 反轉錄為cDNA

20μl反應體系（冰上操作），包含RNA 2.0μg，Oligo（d T）（25 pmol／L）3.0μl，Mg2＋（25 mmol／L）4μl，d NTP（10 mmol／L）2.0μl，AMV （10 U／μl）1.0μl，RNase inhibitor（40 U／μl）1.0μl，RNase Free H2O補足至總體積為20μl。設置反應條件：42℃60 min，95℃5 min，冰浴5 min。

1.5 MT1－MMP及u－PA mRNA相對含量檢測

運用Primer5.0軟件設計引物：MT1－MMP引物：上游：5′－GCC CTA TGC CTA CAT CCG －3′；下游：5′－TGT CAA AGT TCC CGT CAC AG－3′，擴增片段488 bp。u－PA 引物：上游：5′－TAA CTC CAA CAC GCA AGG－3′；下游：5′－CAG CAA GGC AAT GTC GTT－3′，擴增片段106 bp。β－actin引物：上游：5′－AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT－3′；下游：5′－GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT－3′，擴增片段285 bp。引物由大連寶生物公司合成。按照如下反應條件擴增目的基因：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共40個循環；最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖象分析儀分析目的條帶和內參照βactin的灰度，并計算兩者比值。

1.6 統計學分析

數據以均數±標準差（±s）表示，SPSS 12.0軟件處理數據，組間比較采用方差分析及兩兩比較的q檢驗。

2 結果

U87細胞結果見表1，圖1。與正常對照組（NC）相比，HGF組u－PA mRNA 表達顯著增加（P＜0.05）；GDM 組 MT1－MMP和u－PA m RNA表達水平較對照組和 HGF組均顯著降低（P＜0.05）；HGF＋GDM組u－PA mRNA表達水平較對照組和HGF組顯著降低（P＜0.05）。

U251細胞結果見表1，圖2。與正常對照組（NC）相比，HGF組 MT1－MMP及u－PA mRNA表達均顯著增加（P＜0.05）；GDM 組 MT1－MMP和u－PA mRNA表達水平較對照組均顯著降低（P＜0.05）；HGF＋GDM 組 MT1－MMP和u－PA m RNA表達水平較HGF組均顯著降低（P＜0.05）；與單純GDM組相比，HGF＋GDM 組 MT1－MMP m RNA水平顯著增高（P＜0.05）。

表1 Expression of MT1－MMP and u－PA mRNA in U87 and U251 glioma cells（±s，n＝3）

表1 Expression of MT1－MMP and u－PA mRNA in U87 and U251 glioma cells（±s，n＝3）

＊P＜0.05 vs NC，＃P＜0.05 vs HGF，＆P＜0.05 vs GDM

Group The rate of gray scale MT1－MMP u－PA U87 NC 1.174±0.081 1.009±0.013 HGF 1.198±0.028 1.171±0.028＊GDM 1.123±0.019＊＃ 0.863±0.016＊＃HGF＋GDM 1.126±0.056 0.892±0.026＊＃U251 NC 1.411±0.011 1.354±0.042 HGF 1.486±0.075＊ 1.407±0.035＊GDM 1.288±0.018＊＃ 1.221±0.017＊＃HGF＋GDM 1.349±0.036＃＆ 1.231±0.073＃

圖1 Electrophoresis pictures of the effect of GDM on MT1－MMP and u－PA m RNA expression in U87 glioma cell

圖2 Electrophoresis pictures of the effect of GDM on MT1－MMP and u－PA mRNA expression in U251 glioma cell

3 討論

膜型基質金屬蛋白酶－1（MT1－MMP）是位于細胞膜上的基質金屬蛋白酶，其不僅可以直接降解細胞外基質，而且能通過促進 MMP－前體 （pro－MMP－2）的活化，間接的降解細胞外基質。研究發現，在胃癌、肺癌、甲狀腺癌和膠質瘤等腫瘤組織中，MT1－MMP的表達與腫瘤惡性程度和轉移密切相關［3］。上調 MT1－MMP能夠促進膠質瘤細胞轉移［4］，下調MT1－MMP能夠抑制膠質瘤細胞侵襲和轉移［5］。

尿激酶型纖溶酶原激活物（u－PA）是由腫瘤細胞或組織細胞分泌的絲氨酸蛋白酶，既可以酶原形式，也可以活性酶形式結合到特定的細胞表面受體，激活成雙鏈活性形式，活性u－PA可使纖溶酶原激活，除了可催化纖維蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等的降解，還可活化基質金屬蛋白酶（MMP）1、3、9、12，從而進一步破壞細胞外基質，促進腫瘤的侵襲和轉移。高建洲等［6］報道，膠質瘤u－PA的陽性表達可能與其發生和惡性程度有關。膠質瘤細胞分泌的u－PA提供了啟動腫瘤侵襲過程的關鍵性細胞機制，是造成腦膠質瘤治療失敗的主要因素。Schuler等［7］報道u－PA在膠質母瘤C6中顯著高表達，動物實驗顯示，u－PA僅存在于浸潤區和血管基底層，并呈持續高表達。關于HGF與u－PA的關系，研究顯示，HGF與受體c－Met作用后可使u－PA及其受體表達上調，HGF可通過誘導u－PA的表達來促進腫瘤細胞的侵襲能力，這一過程可被一些植物提取物，例如異硫氰酸芐酯阻斷［8］。

在研究運用反轉錄PCR對 MT1－MMP及u－PA m RNA進行半定量分析，結果顯示：HGF能顯著促進膠質瘤細胞中 MT1－MMP及u－PA mRNA表達，而格爾德霉素顯著抑制膠質瘤細胞中MT1－MMP和u－PA表達，且明顯逆轉 HGF對 MT1－MMP及u－PA基因的表達增加趨勢。由此推測，格爾德霉素可能通過抑制HGF－Met通路，降低該通路下游基因MT1－MMP及u－PA的表達，進而降低MMP－2、MMP－9活性，抑制膠質瘤細胞侵襲能力。

［1］王春輝，李蘊潛，羅毅男，等.格爾德霉素對肝細胞生長因子引起的人腦膠質瘤細胞增殖與凋亡變化的影響 ［J］.中國老年學雜志，2008，28（3）：278.

［2］王春輝，李蘊潛，羅毅男，等.格爾德霉素對膠質瘤細胞增殖及相關基因表達的影響 ［J］.吉林大學學報（醫學版），2008，34（2）：199.

［3］Peng CW，Wang LW，Fang M，et al.Combined features based on MT1－MMP expression，CD11b＋immunocytes density and LNR predict clinical outcomes of gastric cancer［J］.J Transl Med，2013，11：153.

［4］Mou L，Kang Y，Zhou Y，et al.Neurokinin－1 receptor directly mediates glioma cell migration by up－regulation of matrix metalloproteinase－2（MMP－2）and membrane type 1－matrix metalloproteinase（MT1－MMP）［J］.J Biol Chem，2013，288（1）：306.

［5］Yongjun Y，Shuyun H，Lei C，et al.Atorvastatin suppresses glioma invasion and migration by reducing microglial MT1－MMP expression［J］.J Neuroimmunol，2013，260（1－2）：1.

［6］高建洲，孔 昕，柳紅艷，等.MMP－9和uPA在腦膠質瘤中的陽性表達及意義 ［J］.山東醫藥，2013，53（5）：62.

［7］Schuler PJ，Bendszus M，Kuehnel S，et al.Urokinase plasminogen activator，uPAR，MMP－2，and MMP－9 in the C6－glioblastoma rat model［J］.In Vivo，2012，26（4）：571.

［8］Kim EJ，Eom SJ，Hong JE，et al.Benzyl isothiocyanate inhibits basal and hepatocyte growth factor－stimulated migration of breast cancer cells［J］.Mol Cell Biochem，2012，359（1－2）：431.