MMP－9和PTEN蛋白在膠質瘤中的表達特點及意義

李秋陽，陳惠麗，李 寧，吳 芳，田 陳，蘇春祥，王梓禎

（首都醫科大學電力教學醫院 病理科，北京100073）

膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，其浸潤性生長的生物學特性是治療不佳的主要原因。基質金屬蛋白酶9（Martix Metalloproteinase 9，MMP－9）是金屬蛋白酶中具有代表性的主要成員之一，目前很多學者在多種腫瘤中已證實惡性腫瘤細胞通過金屬蛋白酶降解細胞外基質以突破組織屏障而發生轉移。第10號染色體同源丟失性磷酸酶－張力蛋白基因（PTEN）是迄今為止發現的堿性磷酸酶家族中第一個腫瘤抑制基因，位于人類染色體10q23，研究發現，在人類多種腫瘤中該基因發生突變。PTEN蛋白是定位于細胞質的磷酸酶，在腫瘤細胞的分化、浸潤、轉移等環節起重要作用。

本研究利用組織芯片和免疫組織化學技術檢測MMP－9和PTEN在膠質瘤組織中的表達特點，并探討它們的意義和相互關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 67例膠質瘤標本來自2000年1月至2004年9月北京電力醫院神經外科收治的患者，經手術切除術后病理診斷為膠質瘤。其中男性41例，女性26例，年齡15－68歲，平均年齡（43.6＋－11.5歲）。按照WHO2000中樞神經系統腫瘤分類標準：2級31例，3級11例，4級25例。正常腦組織標本8例，取自同期經手術切除病理診斷為腦膿腫病例。

1.2 組織芯片的制備 腫瘤標本常規固定、包埋、切片及HE染色，光學顯微鏡下選擇能夠代表腫瘤特點的目標組織區域，分別在組織切片和相應的蠟塊上標記。

1.2.1 組織芯片蠟塊的制作 運用組織芯片手動制作儀細針打孔的方法制作芯片［1，2］，先在空白蠟塊上鉆孔，直徑為2mm，再用金屬空心針（內徑為2 mm）從經定位的目標蠟塊上鉆取組織（一般深度為2－3毫米），并轉移到已鉆孔的空白蠟塊的相應位置，每例組織取一個位點，如此反復將所有標本整齊有序地安插在空白蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。制成的兩個組織芯片均為8×5點陣，起始處用1例睪丸組織定位。總共包括67例腫瘤組織和8例正常腦組織。如圖1所示。

1.2.2 組織芯片蠟塊切片 與常規組織切片相同，切片厚度為4微米，使用APES載玻片，置于4度冰箱保存。如圖1所示。

圖1 組織芯片蠟塊和經HE染色的組織芯片切片

1.3 免疫組織化學染色 免疫組織化學采用En－Vision法。選用的一抗有鼠抗人MMP－9、PTEN多克隆抗體及PV6001、DAB顯色試劑盒。以上均購自中杉生物技術開發有限公司。組織芯片常規脫蠟、水化，室溫下3%H2O2封閉內源性過氧化物酶5分鐘；100度高溫、pH6.0檸檬酸修復15分鐘；滴加鼠抗人多克隆抗體（抗體稀釋度1∶100）；滴加PV6001試劑；DAB顯色，復染后脫水、透明、封片。試劑公司提供的陽性對照作為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4 染色結果判定標準 MMP－9和PTEN蛋白主要定位于細胞漿，其陽性信號均為棕黃色顆粒。采用復旦大學附屬腫瘤醫院提出的判斷標準，首先將著色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕黑色。再按陽性細胞的百分比計分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%－50%為2分，51%－75%為3分，＞75%為4分。將染色強度與陽性細胞百分比乘積作為標準：0－3分為“－”，4－6分為“＋”，7－9分為“＋＋”，10－12分為“＋＋＋”。如圖2所示。

1.5 統計學分析 采用SPSS11.5for windows統計軟件，非腫瘤組和腫瘤組組間 MMP－9、PTEN表達情況的比較采用卡方檢驗，不同病理分級組別MMP－9、PTEN 表達情況比較采用 Kruskal－wallis秩和檢驗，MMP－9、PTEN之間的相關性分析采用Spearman等級相關，以P＜0.05判定為差異具有統計學意義。

圖2 MMP－9和PTEN蛋白免疫組化染色（EnVision法，400×）

2 結果

2.1 免疫組織化學結果

本研究制作包括8例正常腦組織和67例膠質瘤的組織芯片。免疫組織化學陽性信號為棕黃色顆粒，MMP－9、PTEN蛋白主要定位于胞漿。

2.2 正常腦組織和不同 WHO級別膠質瘤的PTEN表達情況。

8例正常腦組織中PTEN全部表達，陽性率為100%。67例膠質瘤中33例呈陽性表達（49.25%），經卡方檢驗發證實正常組和腫瘤組之間PTEN的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。其中31例WHO2級膠質瘤PTEN－ ～＋＋＋表達百分率 分 別 為 41.94%、38.7%、19.35%、0，11 例WHO3級膠質瘤PTEN－ ～＋＋＋表達百分率分別為54.55%、36.36%、9.09%、0，25例 WHO4級膠質瘤PTEN－ ～＋＋＋表達百分率分別為60%、32%、8%、0，發現WHO級別越高的膠質瘤其PTEN表達下降，經Kruskal－Wallis秩和檢驗證實各級別間的PTEN表達差異具有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 8例正常腦組織及67例不同WHO級別膠質瘤中PTEN的表達

2.3 正常腦組織和不同 WHO級別膠質瘤的MMP－9表達情況。

8例正常腦組織中有7例呈MMP－9陽性表達，陽性率為75%。67例膠質瘤中62例呈陽性表達（92.5%），經卡方檢驗證實，正常組和腫瘤組之間MMP－9的表達差異不具有統計學意義（P＞0.05）。其中31例WHO2級膠質瘤MMP－9－ ～＋＋＋表達百分率分別為9.68%、32.26%、35.48%、22.58%，11例WHO3級膠質瘤MMP－9－～＋＋＋表達百分率分別為18.18%、36.36%、45.45%、0，25例 WHO4級膠質瘤MMP－9－ ～＋＋＋表達百分率分別為0、24%、56%、20%，發現WHO級別越高的膠質瘤其MMP－9表達增強，經Kruskal－Wallis秩和檢驗證實各級別間的MMP－9表達差異具有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 8例正常腦組織及67例不同WHO級別膠質瘤中MMP－9的表達

2.4 膠質瘤中MMP－9與PTEN表達相關性

67例膠質瘤MMP－9和PTEN的表達情況如表3。經Spearsman相關分析證實，MMP－9的表達與PTEN的表達無相關性（P＞0.05）。

表3 67例膠質瘤中MMP－9與PTEN的表達關系

3 討論

膠質瘤起源于神經外胚層，其主要特征呈浸潤性生長、容易復發。時至今日膠質瘤的治療仍然是神經外科領域的重大難題。研究發現，膠質瘤的浸潤和轉移過程涉及腫瘤細胞黏附、基質降解、細胞遷移等許多環節，細胞外基質在腫瘤的浸潤和侵襲過程中起著關鍵作用。膠質瘤細胞可以分泌蛋白水解酶降解、破壞由細胞間質組成的細胞外基質，促進腫瘤侵襲轉移。因此，了解腫瘤細胞浸潤機制將有可能為膠質瘤的治療帶來突破性進展。

基質金屬蛋白酶（Martix Metalloproteinase，MMPs）是蛋白水解酶中較為重要的一類，它們通過對細胞外基質的降解促進腫瘤細胞向周圍組織侵襲。目前普遍認為，MMPs涉及惡性腫瘤相關的多個過程，包括腫瘤侵襲、轉移、血管生成及腫瘤的增殖［3］。其中 MMP－9是分子量為92kDa的明膠酶B，由巨噬細胞、結締組織和某些腫瘤細胞合成分泌，與組織發生、傷口愈合以及腫瘤的浸潤轉移密切相關。我們的研究發現，MMP－9在膠質瘤中的陽性表達率（92.62%）高于正常腦組織（75%），但統計學檢驗沒有顯著性差異（P＞0.05），我們考慮可能由于實驗納入的正常腦組織樣本過少有關。研究發現隨著膠質瘤惡性級別的升高，MMP－9表達增強（P＜0.05），這說明 MMP－9的表達與膠質瘤的侵襲性密切相關。有研究表明，應用Northern blotting和免疫組織化學技術對臨床組織標本檢測表明，膠質瘤中存在MMP－9的轉錄和表達并隨膠質瘤惡性程度的增高其轉錄和表達水平亦明顯增加，提示膠質瘤的侵襲性與其MMPs表達與活化有密切關系［4－5］。

PTEN是具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，研究發現，在人類多種腫瘤中該基因發生突變。PTEN蛋白定位于胞漿，主要功能區位于N端，是酶的催化中心。PTEN的腫瘤抑制作用主要依賴其脂質磷酸酶活性，但其蛋白磷酸酶活性仍可以影響細胞增殖、黏附和細胞遷移［6－8］。大量研究表明，PTEN在許多腫瘤中表達缺失，在腫瘤細胞的增殖、分化和腫瘤浸潤轉移中起到一定作用。本研究發現，PTEN在膠質瘤的陽性表達率（49.25%）明顯低于正常腦組織（100%）（P＜0.05），提示PTEN基因突變或丟失、滅活在膠質瘤的發生過程中起到重要作用。本研究還提示，隨著膠質瘤惡性程度的升高，PTEN蛋白陽性表達降低（P＜0.05），提示PTEN基因異常與膠質瘤惡性轉化有關，這與其他學者的研究結果相同［9］。因此我們推斷PTEN表達下調或缺失在由低度惡性膠質瘤向高度惡性膠質瘤的轉化過程中起著十分重要的作用。

膠質瘤是一種多種基因異常的疾病，癌基因的激活和過表達及抑癌基因的突變、缺失使腫瘤逃避正常生長調控機制而失控增殖［10］。因此有必要聯合多種基因來細分研究。文獻報道PTEN主要通過調節P130蛋白、基質金屬蛋白酶和血管內皮生長因子的活性影響腫瘤細胞的增長、侵襲等生物學行為。我們知道PTEN基因表達異常與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，其能通過影響FAK的磷酸化在腫瘤的浸潤、血管生成過程中起作用，能夠影響細胞局部黏附和運動遷移能力。Hwang發現，PTEN可以調節MMPs表達，進而調節腫瘤細胞的遷徙和轉移。本實驗結果顯示，67例膠質瘤中，MMP－9與PTEN的表達沒有相關性（P＞0.05），因此我們的研究結果尚不能支持MMP－9異常激活與PTEN基因表達缺失有密切關系這一判斷。PTEN基因表達下調與MMP－9異常激活的相關性有待于多種技術方法進一步闡明。

本研究結果提示，MMP－9和PTEN在膠質瘤的發生、發展中起著重要作用，MMP－9的高表達和PTEN的表達下降提示膠質瘤的侵襲性增高，兩種指標的聯合應用可作為膠質瘤病理分級診斷及判斷預后的重要參考依據。

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