MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌中的表達及意義

王玲玲，高 申，孫 莉，趙海豐，宋麗娜，師慶紅，王 海，郭宏華，何成彥

（1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.吉林大學第二臨床學院，吉林 長春130041；3.佳木斯大學附屬第一醫院）

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，是多種致癌因素共同作用發生的惡性病變。在全世界范圍內，大腸癌是第三大惡性腫瘤，其病死率占全部癌癥的第二位［1］。大腸癌的發生發展與基因的異常表達密切相關，涉及ras、myc等原癌基因的激活和APC、MCC、P53、P73等抑癌基因的失活。隨著分子生物學的快速發展，關于大腸癌發生發展的機制和腫瘤標記物的研究進展迅速。本研究針對大腸癌組織、癌旁組織和健康對照三組樣本，選取MCC、Survivin、P73和RhoA等四種基因進行檢測，探討以上指標與大腸癌發生發展的關系，為大腸癌發病機制的研究提供相關依據。

1 材料和方法

1.1 對象 選取吉林大學第二醫院就診的大腸癌患者癌組織和癌旁10cm以外的正常組織作為檢測對象，癌組織均經病理檢查證實為Dukes A期；對照組為20例取自因腹部外傷時的健康人的正常結腸組織。所有病例均簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會審校批準。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取100mg組織樣品，加入1 ml的TRIZOL試劑，勻漿。勻漿后樣品于15－30℃孵育5min，加入0.2ml的氯仿，振蕩15秒，15－30℃孵育2－3min；4℃，12 000r／min離心15分鐘。RNA沉淀：將水相轉移到新離心管中，加入0.5ml的異丙醇，混勻后15－30℃孵育10min；4℃，12 000 r／min離心10min。移去上清液，加入1ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀，振蕩；4℃，7 500r／min離心5分鐘。在空氣中干燥RNA沉淀5－10min。加入無RNA酶的水，反復吹打幾次，55－60℃孵育10 min，獲得的RNA溶液保存于－70℃。

1.2.2 RNA質量檢測 采用變性瓊脂糖凝膠電泳來觀察RNA的質量。其具體步驟如下：將1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60°C，加入10ml的10×MOPS電泳緩沖液和18ml 37% 甲醛溶液；灌制凝膠板，膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的MOPS電泳緩沖液；取5μl RNA，加等體積的2×甲醛上樣染液，再加入少量EB；上樣，在5–6V／cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2－3 cm；紫外透射光下觀察并拍照，28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的亮度大約是下面一條帶的2倍。

1.2.3 cDNA合成 按以下條件配制反應液：buffer 2μl，上游引物（TAKARA公司設計）0.2μl，下游引物（TAKARA 公司設計）0.2μl，dNTP 0.1 μl，逆 轉 錄 酶 MMLV（TAKARA 公 司）0.5μl，DEPC水5μl，RNA模版2μl，混勻，6 000rpm 瞬時離心。混合液在加入逆轉錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘；取出后立即95℃干浴3分鐘，得到cDNA溶液，保存于－80℃待用。

1.2.4 實時熒光定量 PCR SYBR Green 1染料（TAKARA公司）10μl，上游引物F 0.5μl，下游引物R 0.5μl，dNTP 0.5μl，Taq酶1μl，模板DNA 5 μl，ddH2O 32.5μl，總體積 50μl；混勻，6 000rpm瞬時離心，于Real time PCR儀上進行擴增反應。反應程序設定：第一步：93℃2min，第二步：93℃1 min，55℃ 1min，72℃ 1min，40個循環，第三步：72℃7min。PCR反應完后，取PCR產物跑2%瓊脂糖凝膠電泳，并加DNA Ladder作為參考，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶；用軟件分析數據，記錄反應體系中熒光信號的強度CT值，以GAPDH為內參，2－△△CT法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 MCC、Survivin、P73、RhoA和內參基因引物序列

1.3 統計學分析 每組數據以均數±標準差（x—±s）表示，將P＜0.05設為顯著性差異的標準。采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌組織中的表達均顯著高于癌旁組織和健康人結腸組織（P＜0.01），而在癌旁和健康對照組中表達變化不大；4種基因在癌組織、癌旁組織和健康對照組中的表達情況見圖1。

圖1 Real time PCR檢測 MCC、Survivin、P73和RhoA在大腸癌中的表達

3 討論

MCC基因編碼829個氨基酸，是1991年由Kinzler等人發現的，其與早期直結腸癌有密切關系。Fukuyama等［2］在研究鋸齒狀結腸癌時，發現MCC可能是一個潛在的腫瘤抑制因子，它可以抑制Wnt／β－連鎖蛋白信號轉導通路。近年來，關于MCC突變的研究較多，其突變發生于大腸癌早期［3］；有學者發現，MCC基因在大腸癌及癌旁組織的突變率與正常組織差異有統計學意義，而癌組織與癌旁之間差異無顯著性［4］。本研究顯示，MCC在大腸癌組織中的表達顯著高于癌旁及健康對照組，而癌旁與健康對照之間表達無統計學意義。根據MCC突變及表達情況，我們可以了解到其在大腸癌發生發展過程中發揮重要作用。Surivin基因長度14.5kb，含有4個外顯子、3個內含子；Surivin是凋亡抑制蛋白家族成員之一，可以抑制細胞凋亡、促進腫瘤增殖、誘導血管生成。Surivin分布具有組織特異性，在正常成人組織的表達僅見于胸腺、睪丸和分泌期的子宮內膜；在大多數腫瘤組織中有高表達，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、骨肉瘤和淋巴瘤［5］。Survivin與腫瘤的發生發展密切相關，有望成為腫瘤治療的新靶點［6］。P73基因是Kaghad等在1997年發現的，定位于1p36.2－36.3，與P53在結構和功能上有相似性。P73過表達能夠激活P53的靶基因，可以誘導細胞凋亡［7］。P73高表達預示臨床預后較差，提示其在腫瘤發生過程中起到促進腫瘤進展的作用。Rho家族主要包括 Rho（A、B、C）、Rac和cdc42三個亞家族，其中RhoA在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用。有學者對小鼠骨癌模型進行研究時發現，RhoA參與癌性骨痛的發展過程［8］。還有學者研究發現，在乳腺癌患者體內RhoA不僅表達高，而且與埃茲蛋白的表達機制有關，為腫瘤的治療提供了新的靶點［9］。

本研究結果顯示，MCC、Survivin、P73和RhoA在癌組織高表達，表明它們在大腸癌的發生發展過程中起重要作用。隨著分子生物學技術的迅猛發展，相信我們會對越來越多的基因促進大腸癌發生發展的機制有更深一步的了解，從而為大腸癌發病機制和基因干預治療的進一步研究奠定理論依據和實驗基礎。

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