BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)水平與在大腸癌鉑類化療預(yù)后的相關(guān)性研究

劉燕文，魯 凱，賈建英，葉紅玲，姜維美

（連云港市第二人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，江蘇 連云港222023）

鉑類是大腸癌患者最常用的化療藥物，但在不同種族人群中、不同個(gè)體間仍有顯著的化療有效率／毒性反應(yīng)，目前應(yīng)用的抗腫瘤藥物對(duì)至少70%的患者療效有限，20%－40%的患者甚至有可能接受了錯(cuò)誤的藥物治療［1］，因此對(duì)腫瘤藥物的療效預(yù)測(cè)成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。乳腺癌易感基因家族（breast cancer susceptibility gene BRCA）通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA重組修復(fù)等發(fā)揮腫瘤抑制功能及參與DNA修復(fù)，其功能失活與散發(fā)性乳腺癌、卵巢癌發(fā)生有關(guān)。近來(lái)的研究顯示BRCA－1與紫杉類及鉑類藥物療效相關(guān)，是提示預(yù)后及化療療效的預(yù)測(cè)分子［2，3］。錯(cuò)配切除修復(fù)蛋白（excision repair cross complement1ERCC1）是DNA修復(fù)途徑中最主要的基因之一［4］，目前研究表明其mRNA或蛋白低表達(dá)與鉑類為基礎(chǔ)的非小細(xì)胞肺癌化療的總生存時(shí)間延長(zhǎng)存在明顯的相關(guān)性［5］。因此，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－qPCR）檢測(cè)大腸癌患者的石蠟包埋組織中 BRCA－1mRNA、ERCC－mRNA 表達(dá)，研究其與臨床病理特征及與預(yù)后的關(guān)系，為大腸癌患者個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2005年07月至2010年10月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)、資料完整的大腸癌患者54例，其中，男34例，女20例，中位年齡65歲（44－78歲）。臨床分期按第七版AJCC腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)，其中臨床Ⅰ、Ⅱ期30例，Ⅲ期8例，Ⅳ期16例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，所有患者均在我院接受化療并有完整的隨訪資料，隨訪時(shí)間至2012年10月，化療方案采用以?shī)W沙利鉑為基礎(chǔ)的方案（表1）。

1.2 治療方法 mFOLFOX方案：奧沙利鉑85 mg／m2第1天，亞葉酸鈣400mg／m2第1天，5－氟尿嘧啶400mg／m2靜推第1天，繼5－氟尿嘧啶2 000mg／m2CIV46小時(shí)，雙周方案，共六周期。

1.3 臨床觀察及評(píng)價(jià) 主要觀察指標(biāo)總生存時(shí)間（overall survival，OS），次要觀察指標(biāo)至腫瘤進(jìn)展時(shí)間（Time－To－Progression TTP）。總生存時(shí)間為從確診之日起（手術(shù)日）至末次隨訪或死亡（死于原發(fā)腫瘤或并發(fā)癥）的時(shí)間。至腫瘤進(jìn)展時(shí)間為從首次化療到病人出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的時(shí)間。

1.4 主要試劑及儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7900HT Fast）購(gòu)自美國(guó)ABI公司 ；核酸蛋白檢測(cè)儀（Eppendorf Biophotometer plus）購(gòu)自德國(guó)艾本德公司；石蠟RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；熒光染料購(gòu)自美國(guó)AB公司；引物由上海生工公司合成。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 SYBR Green RT－qPCR 檢 測(cè) BRCA－1mRNA表達(dá)按照試劑盒說(shuō)明提取石蠟RNA（RNase－free FFRE Kit，Qiagen），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT反應(yīng)體系10μl：gDNA：1μl，2μl RNA和4μl DEPC－H2O 42℃ 2min，然后加入0.5μl Primer（10nmol／μl），0.5μl RT 酶，Buffer：2μl，42℃30min，95℃5min。上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，定量PCR反應(yīng)體系：Master Mix：2.5μl，模板cDNA 1 μl，上下游引物各0.25μl（20pmol／μl），H2O 1μl，（5μl體系）。反應(yīng)條件：94 ℃30s，60 ℃1min，68℃2min，40個(gè)循環(huán)，最后68℃7min。利用軟件分析其Ct值，與其對(duì)應(yīng)的Beta－actin基因的量進(jìn)行校正，CUT OFF值取實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)值BRCA－1 6.5，ERCC4.8，小于CUT OFF值定義為低表達(dá)，大于等于CUT OFF值定義為高表達(dá)。

1.5.2 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GeneBank報(bào)道的人ERCC－1，BRCA－1基因cDNA設(shè)計(jì)引物如下：

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用COX回歸法進(jìn)行多因素分析，生存分析采用Kaplan－Meier法，生存率的比較采用Log－rank法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRCA－1mRNA結(jié)果 所有大腸癌組織中均有BRCA－l mRNA 表達(dá)，其 RT－qPCR 體系無(wú)非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)穩(wěn)定，重復(fù)性好。54例大腸癌患者中，BRCA－1mRNA低表達(dá)20例（37.04%），高表達(dá)34例（62.97%）。BRCA－1mRNA 表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.034；P＝0.037）。

2.2 BRCA－1mRNA表達(dá)水平與54例患者總生存時(shí)間的關(guān)系 BRCA－1低表達(dá)水平組：中位生存時(shí)間 MST（47.84月）；BRCA－1高表達(dá)水平組：中位生存時(shí)間 MST（35.36月），二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.137）（表2，圖1）。

2.3 BRCA－1mRNA表達(dá)水平與16例晚期大腸癌患者總生存時(shí)間及至腫瘤進(jìn)展時(shí)間的關(guān)系 總生存時(shí)間：BRCA－1mRNA 高表達(dá)患者（32.6月）長(zhǎng)于低表達(dá)患者（9.5月，P＝0.026）；至腫瘤進(jìn)展時(shí)間：BRCAmRNA高表達(dá)患者（10.3月）長(zhǎng)于低表達(dá)患者（4.3月，P＝0.026）（表3）。

2.4 ERCCmRNA結(jié)果 所有大腸癌組織中均有ERCCmRNA表達(dá)，其RT－qPCR體系無(wú)非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)穩(wěn)定，重復(fù)性好。54例大腸癌患者中，ERCCmRNA低表達(dá)14例（25.93%），高表達(dá)40例（74.07%）。ERCC1mRNA表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

2.5 ERCCmRNA表達(dá)水平與54例患者總生存時(shí)間的關(guān)系 ERCC低表達(dá)水平組：中位生存時(shí)間MST（49.50月）高于低表達(dá)患者（30.33月，P＝0.014）。

2.6 ERCCmRNA表達(dá)水平與16例晚期大腸癌患者總生存時(shí)間及至腫瘤進(jìn)展時(shí)間的關(guān)系 總生存時(shí)間：ERCCmRNA低表達(dá)患者（41.1月）長(zhǎng)于高表達(dá)患者（20.7月，P＝0.018）；患者至腫瘤進(jìn)展時(shí)間：ERCCmRNA高表達(dá)患者（9.5月）長(zhǎng)于低表達(dá)患者（8.9月，P＝0.966）。

2.7 ERCC 與 BRCA－1表達(dá)具有正相關(guān)性（r＝0.497 P＜0.05）。

3 討論

鉑類藥物是治療大腸癌的有效藥物之一，但不同患者對(duì)治療的敏感性存在顯著差異，預(yù)后也不同。其作用機(jī)制主要通過(guò)和細(xì)胞DNA雙鏈耦合形成加合物或形成鏈間交叉連接而損傷DNA，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡，殺滅腫瘤細(xì)胞。DNA修復(fù)能力是影響鉑類藥物療效的重要原因，ERCC1－1是核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）途徑的限速酶，在NER途徑中起著DNA損傷識(shí)別和鏈間切割的關(guān)鍵作用，它的表達(dá)降低一方面預(yù)示腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加，腫瘤細(xì)胞惡性程度高，易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移［6］，但我們的研究顯示ERCC－1的表達(dá)與大腸癌分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目等惡性生物學(xué)行為無(wú)關(guān)（P＞0.05），提示ERCC－1盡管參與了腫瘤的惡性生物學(xué)行為，但由于大腸癌發(fā)生發(fā)展的不同階段是多基因參與、多因素共同作用的結(jié)果，因此并未對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性表型起決定性作用。另一方面ERCC－1表達(dá)降低提示腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA靶向性藥物的修復(fù)能力降低，進(jìn)而增加藥物敏感程度，更易從此類藥物治療中獲益［7］。研究表明ERCC－1高表達(dá)能使順鉑誘導(dǎo)DNA結(jié)合物的清除率增加，從而降低順鉑的療效以及肺癌患者的生存時(shí)間。ERCC1表達(dá)與肺癌含鉑方案化療生存時(shí)間的關(guān)系經(jīng)國(guó)際多中心研究證實(shí)有肯定價(jià)值［8］：只有ERCC1低表達(dá)者可從化療中獲益，高表達(dá)不會(huì)獲得臨床療效，卻增加藥物毒副作用。Shirota Y［9］研究50例大腸癌腫瘤組織ERCC1，ERCC1低于臨界值，其 MST為10.2月，高于臨界值，其MST為1.9月，我們的研究也提示ERCC－1低表達(dá)患者在接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療后，晚期患者的總生存時(shí)間及所有期別患者的總生存期均長(zhǎng)于高表達(dá)患者，提示ERCC－1不但是鉑類藥物的分子預(yù)測(cè)指標(biāo)，其低表達(dá)不管在早期還是晚期患者中均為預(yù)后良好的預(yù)測(cè)因素，多因素分析亦顯示ERCCmRNA低表達(dá)可以作為大腸癌患者預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，這與國(guó)外研究結(jié)論基本一致。

表1 54例大腸癌患者的臨床資料

表2 BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)與大腸癌患者OS的關(guān)系

表3 BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)與16例晚期大腸癌患者OS、TTP的關(guān)系

圖 A the OS of BRCA－1low－expression and high－expression（1.00 low－expression；2.00high－expression）圖B the OS of ERCC low－expression and high－expression（1.00lowexpression；2.00high－expression）

BRCA－1的重要功能是G2－M檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)節(jié)，BRCA在有絲分裂期間聯(lián)合定位于中心體，控制有絲分裂紡錘體的組裝及子代細(xì)胞特有的染色體分離，從而影響細(xì)胞的分化。相關(guān)的研究表明，BRCA－1高表達(dá)預(yù)示著腫瘤惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，在乳腺癌及肺癌中已有報(bào)道［10，11］，但我們的研究提示BRCA－1mRNA的表達(dá)與腫瘤分期、及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為有顯著相關(guān)性（P＜0.05），但與腫瘤的分化程度及病理類型無(wú)關(guān)，說(shuō)明BRCA可能通過(guò)基因調(diào)控多途徑參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但不參與腫瘤分化過(guò)程的調(diào)節(jié)。同時(shí)BRCA直接參與DNA的修復(fù)，BRCA－1編碼對(duì)DNA損害起反應(yīng)的蛋白，這些蛋白產(chǎn)物與Rad51及其它已知參與DNA修復(fù)的蛋白之間均有作用，BRCA的功能失活導(dǎo)致DNA斷裂的修復(fù)功能降低，從而使患者對(duì)DNA交聯(lián)劑、誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的藥物如鉑類敏感［7］。Rosell［12］等報(bào)道在接受以鉑類為基礎(chǔ)化療方案的非小細(xì)胞肺癌患者中，BRCA－1低表達(dá)的2年生存率高于BRCA－1高表達(dá)者，可見(jiàn)BRCA－1低表達(dá)患者能從鉑類藥物的治療中獲益。我們的結(jié)果顯示BRCA－1低表達(dá)患者在接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療后，低表達(dá)患者總生存期長(zhǎng)于高表達(dá)患者，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的研究顯示在晚期大腸癌患者中，其高表達(dá)患者總生存時(shí)間及至疾病進(jìn)展時(shí)間均長(zhǎng)于低表達(dá)患者（P＜0.05），分析結(jié)果考慮與BRCA－1表達(dá)與患者分期有顯著相關(guān)性有關(guān)，在我們研究的16例晚期大腸癌患者中，有14例患者高表達(dá)，因此可能造成數(shù)據(jù)的偏倚性。因此也提示盡管其表達(dá)水平與ERCC表達(dá)存在正相關(guān)性，但BRCA可能在不同分期中有不同的預(yù)測(cè)意義，目前BRCA－1尚不能作為大腸癌患者鉑類藥物化療療效及預(yù)后的分子預(yù)測(cè)指標(biāo)。

總之，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)大腸癌患者BRCA－1、ERCCmRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示ERCCmRNA表達(dá)水平可以作為預(yù)測(cè)大腸癌患者鉑類化療及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，而B(niǎo)RCA－1mRNA盡管與ERCCmRNA表達(dá)有正相關(guān)性，但其表達(dá)在不同期別患者中存在相反的結(jié)果，因此目前尚沒(méi)有足夠證據(jù)作為大腸癌患者預(yù)后及鉑類化療的預(yù)測(cè)因素，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

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