KGF及KGFR共表達促進鐵過載肝細胞增殖

安樹才，張智斌

（1.青島大學附屬醫院 甲狀腺外科，山東 青島 266003；2.佳木斯大學附屬第一醫院 普外一科，黑龍江 佳木斯 154002）

肝臟是鐵代謝的主要器官，大量鐵的吸收破壞了細胞內鐵的平衡導致鐵缺乏或鐵過載。鐵過載可引起肝細胞損傷導致肝細胞纖維化甚至肝硬化［1－2］，并和肝臟腫瘤發生相關［3－4］，在肝硬化和非肝硬化患者中鐵過載可促進肝細胞癌的發生［5］。另外，丙型肝炎病毒感染患者經過長期的降鐵藥物治療后，可以使肝臟功能得到明顯改善［6－7］。有證據表明在感染HCV的年輕肝癌患者中鐵過載和肝癌的發生有著密切的關系［8］。但是，鐵過載和肝細胞增殖之間的相關性尚不清楚。正常情況下肝細胞處于較慢的一個增殖狀態，但是在經過諸如部分肝切除等各種損傷后，肝細胞再生被激活［9－10］，這為我們提供了實驗模型來研究鐵過載在肝細胞增殖中的作用。

角質細胞生長因子（keratinocyte growth facto，KGF）屬于成纖維細胞生長因子家族，也叫FGF－7，來源于角質形成細胞，是對上皮細胞具強促分裂原活性的一種生長因子［11］。KGF和KGF受體（KGFR）相互結合參與細胞的增殖，而且KGFR特異性存在于上皮細胞內［12］。KGF是一個重要的增殖和分化因子，并且在上皮細胞系促進細胞的生長［13－15］，包括胃腸和肝臟細胞［16－17］。KGF在體內和體外對肝細胞是一個強有力的促分裂素［16，18］。KGF 和KGFR在肝纖維化中出現共表達［19］，但是在鐵過載的情況下對肝細胞中的表達未見報道。本文旨在通過喂食大鼠3%羰基鐵的鐵過載動物模型，70%部分肝切除來探討鐵過載在肝細胞中的KGF和KGFR的表達并探討其作用。

1 材料及方法

1.1 材料

多聚甲醛（POM）購自德國默克公司，3，3’－二氨基聯苯胺－4－鹽酸（DAB）購自日本Dojin化學制品公司，胎牛血清白蛋白（BSA）、正常抗小鼠Ig G和抗兔IgG購自美國Sigma公司，戊巴比妥購自日本Dainippon制藥公司。辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的山羊抗小鼠IgG F（ab）’購自日本名古屋醫療生物實驗室；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的山羊抗生物素抗體購自美國加利福尼亞伯靈格姆向量實驗室；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的綿羊抗地高辛（1∶100）購自羅氏公司。KGF和KGFR抗體由日本長崎大學小路武彥教授提供。本實驗應用的所有其他試劑購自日本和光純藥工業株式會社。

1.2 鐵過載大鼠肝臟部分切除模型制備

健康雄性 Wistar大鼠40只，每組5只，清潔級，7－8周齡，體重200－250 g，佳木斯大學動物中心提供。隨機分為正常組和實驗組。正常組喂食普通食料，實驗組喂食添加3%羰基鐵食料。各組喂食3個月后通過腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg／kg）進行麻醉，待麻醉滿意后切開腹腔顯露肝臟行70%肝臟部分切除術［20］。肝臟樣本在不同的時間點（0 h，12 h，24 h，36 h）離體，在4%磷酸鹽緩沖液（PBS）中4℃過夜固定、石蠟包埋。制備5－6μm厚度切片，部分用以HE染色進行組織學檢測。

1.3 方法

鐵在肝臟中沉積程度采用普魯士藍染色方法檢測，方法見文獻［8］。KGF和KGFR采用酶聯免疫組織化學方法測定，按試劑盒說明書進行。HRP的位點在鎳鈷鐵存在或不存在的情況下可以通過DAB和 H2O2可視化［21，22］。在實驗進行中各陰性對照樣本與正常兔IgG反應，而不是特異性一抗。

原位雜交方法：KGF和KGFR的探針分別為No.648－683和 No.1388－1432［23］。然后在37℃和42℃條件下雜交過夜，使用的介質中含有10 m M Tris－HCl（PH 7.4），1 m M 的乙二胺四乙酸，0.6 m M 的NaCl，1×Denhardt氏溶液，250 mg／ml酵母轉移核糖核酸，125 mg／ml鮭魚睪丸DNA，10%硫酸葡聚糖，200 U／ml的肝素，10 mg／ml多聚腺苷酸鉀的鹽，40%去離子甲酰胺和2 mg／ml－T二聚的KGF探針或T－T二聚KGFR探針。雜交后將切片在37℃下，在2xSSC／50% 甲酰胺／0.075%Brij 35中洗滌3次，再在37℃下，在0.5xSSC／50% 甲酰胺／0.075%Brij 35中洗滌1小時，最后在室溫下，在2xSSC中洗滌15分鐘。切片行酶學免疫組化處理。將切片在封閉液（封閉液中成分：PBS中加入5%BSA，0.3 m M 的 NaCl，100 mg／ml鮭魚睪丸DNA，100 mg／ml酵母轉移RNA，和500 mg／ml正常小鼠IgG）中室溫條件下孵化1小時，然后切片在室溫下，與1：80的HRP小鼠抗T－T－G抗體反應過夜。在PBS中用0.075%Brij 35洗滌后，用過氧化氫和DAB將HRP位點進行可視化處理。通過染色密度來評價陽性細胞，該染色密度是使用圖像分析儀，通過測量正義探針染色水平來確定的。通過多種對照實驗來確認特異性mRNA信號。每次實驗中，正義探針都作為陰性對照。在每個實驗中，用28S r RNA探針作為陽性對照，來評估組織切片中雜交RNA的水平。此外，為了提供確鑿證據，用一些切片在過量未標記反義探針或正義探針中與反義探針雜交，來證明前面提到的信號序列的特異性。

1.4 數據分析 所有數據以平均數±SE表示，非配對t檢驗進行組間數據顯著性分析。P≤0.05代表有顯著性差異。所有分析均以數據分析包（Stat－View，version 5.0；Abacus Concepts，Berkeley，CA，USA）進行統計分析。

2 結果

2.1 鐵沉積

正常組在各個時間均未檢測到鐵的沉積。實驗組在0小時發現位于肝小葉中央靜脈中央帶的肝細胞質中表達（圖1D），12 h發現在中央帶的肝細胞質中表達增強（圖1F），并隨時間鐵沉積的表達逐漸減弱（圖1 H）。

2.2 KGF和KGFR蛋白的表達

KGF在正常組從12 h肝小葉中央靜脈周圍肝實質細胞和肝間質細胞中的細胞質中有表達，到36 h這種表達達到最強（圖2 E）。實驗組12 h同樣檢測出KGF表達，到24 h這種表達最為顯著（圖2 F）。KGFR的表達在正常組中0 h肝實質細胞的細胞質中出現，并隨時間增加而逐漸增強，到36 h達到高峰（圖3 E）。實驗組0 h只檢測出少量KGFR陽性細胞，到24 h達到最高隨后減少（圖3 F）。

圖1 各個時間段肝臟中鐵沉積。正常組（A，C，E，G）；實驗組（B，D，F，H），黑色箭頭為肝臟中鐵沉積細胞。標尺：50μm。

圖2 各個時間段肝臟中KGF陽性細胞。正常組（A，C，E）；實驗組（B，D，F），黑色箭頭為肝臟中KGF陽性細胞。標尺：50μm

圖3 各個時間段肝臟中KGFR陽性細胞。正常組（A，C，E）；實驗組（B，D，F），黑色箭頭為肝臟中KGF陽性細胞。標尺：50μm。

2.3 KGF和KGFR mRNA的表達

正常組KGF mRNA在肝細胞中只有少量的表達（圖4 A），在實驗組中這種表達增加（圖4 C）。在實驗組24 h KGF mRNA的表達達到最高（圖4 G），這種表達最重要是在肝實質細胞核中。同樣的KGFR mRNA的表達和KGF mRNA表達是一致的（圖5）。

3 討論

肝臟中的鐵沉積在肝切除術后迅速減弱，使得12－36 h肝竇部的肝細胞鐵沉積明顯，這與運用鐵螯合劑治療小鼠幼鼠血色素沉積癥相似［24］。盡管本研究并未探討原因，但肝細胞中的鐵代謝在再生過程中是發生改變的。我們的實驗證明在肝切除實驗組24 h KGF和KGFR的蛋白水平和mRNA的表達同一時間到達最高，比正常組提前12 h。

血管內皮生長因子（VEGF）、紅細胞生成素（erythropoietin）和基質金屬蛋白酶（MMPs）對再生改善、組織重構和肝細胞復制有影響。然而，盡管VEGF被認為參與血管生長以及肝細胞增殖，但是VEGF并未被驗證誘導肝再生［10］。相似的，盡管報導肝再生時紅細胞生成素的合成增加，但其在肝再生中的作用尚存在爭議［25］。因為肝臟細胞外基質是多種生長因子（如HGF和肝素結合生長因子等）的儲存器，所以在組織重構的過程中組織基質的降解是必要的。事實上，人們已經認識到MMP－14和它的組織抑制劑（TIMP－1）在肝臟再生的早期階段即可被特異性誘導，然而，它們在肝臟再生誘導中的作用尚未證實［26］。轉化生長因子－α（TGF－α）參與肝細胞再生，但是確切的機理尚不清楚［27］。我們先前的研究證實在鐵過載的情況下NF－KB參與了肝細胞增生［22］。KGF存在于間質細胞和T細胞中，并且可以在上皮細胞中表達，KGF和KGFR的特異性結合引起細胞的增殖。KGF在慢性肝病中的星狀細胞中有表達［28］，KGF和KGFR在肝纖維化中共表達［19］，但是在鐵過載的情況下對肝細胞的表達未見報道。我們的實驗證明KGF和KGFR在肝細胞中蛋白和mRNA同時表達，并且在實驗組24小時達到最大，比正常組提前，并且在先前的研究中已經證明在這個時段細胞數和肝臟重量有顯著意義增加，證明KGF和KGFR參與肝細胞再生。KGF可以通過NF－KB的調節改變其表達［29］，但是確切的作用機理還有待于進一步研究。我們推測由于嚴重鐵沉積所維持的NF－κB激活KGF和KGFR共表達，可能繞過了肝切除后通常的肝臟再生通道順序引起肝細胞的增生。

圖4 各個時間段肝臟中KGF mRNA表達。正常組（A，C，E，G）；實驗組（B，D，F，H），黑色箭頭為肝臟中 KGFmRNA陽性細胞。標尺：50μm。

圖5 各個時間段肝臟中KGFR mRNA表達。正常組（A，C，E，G）；實驗組（B，D，F，H），黑色箭頭為肝臟中 KGFmRNA陽性細胞。標尺：50μm。

［1］Pietrangelo A，Rocchi E，Schiaffonati L，et al.Liver gene expression during chronic dietary iron overload in rats［J］.Hepatology，1990，11：798.

［2］Hentze MW，Muckenthaler MU，Andrews NC.Balancing acts：molecular control of mammalian iron metabolism［J］.Cell，2004，117：285.

［3］Turlin B，Juguet F，Moirand R，et al.Increased liver iron stores in patients with hepatocellular carcinoma developed on a noncirrhotic liver［J］.Hepatology，1995，22：446.

［4］Kowdley KV.Iron，hemochromatosis，and hepatocellular carcinoma［J］.Gastroenterology，2004，127：S79.

［5］Di Bisceglie AM.Hepatitis C and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，1997，26：34S.

［6］Kato J，Kobune M，Nakamura T，et al.Normalization of elevated hepatic 8－hydroxy－20－deoxyguanosine levels in chronic hepatitis C patients by phlebotomy and low iron diet［J］.Cancer Res，2001，61：8697.

［7］Yano M，Hayashi H，Yoshioka K，et al.A significant reduction in serum alanine aminotransferase levels after 3－month iron reduction therapy for chronic hepatitis C：a multicenter，prospective，randomized，controlled trial in Japan［J］.J Gastroenterol，2004，39：570.

［8］Soe K，Hishikawa Y，Fukuzawa Y，et al.Possible correlation between iron deposition and enhanced proliferating activity in hepatitis C virus－positive hepatocellular carcinoma in Myanmar（Burma）［J］.J Gastroenterol，2007，42：225.

［9］Fausto N，Campbell JS，Riehle KJ.Liver regeneration［J］.Hepatology，2006，43：S45.

［10］Michalopoulos GK.Liver regeneration［J］.J Cell Physiol，2007，213：286.

［11］Rubin JS，Osada H，Finch PW，et al.Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86：802.

［12］Miki T，Fleming TP，Bottaro DP，et al.Expression cDNA cloning of the KGF receptor by creation of a transforming autocrine loop［J］.Science，1991，251：72.

［13］Tamaru N，Hishikawa Y，Ejima K，et al.Estrogen receptor－associated expression of keratinocyte growth factor and its possible role in the inhibition of apoptosis in human breast cancer［J］.Lab Invest，2004，84：1460.

［14］Yamayoshi T，Nagayasu T，Matsumoto K，et al.Expression of keratinocyte growth factor／fibroblast growth factor－7 and its receptor in human lung cancer：correlation with tumour proliferative activity and patient prognosis［J］.J Pathol，2004，204：110.

［15］Yamamoto S，Asanuma T，Takagi T，et al.The molecule role ontology：an ontology for annotation of signal transduction pathway molecules in the scientific literature［J］.Comp Funct Genomics，2004；5：528.

［16］Housley RM，Morris CF，Boyle W，et al.Keratinocyte growth factor induces proliferation of hepatocytes and epithelial cells throughout the rat gastrointestinal tract［J］.J Clin Invest，1994，94：1764.

［17］Bosch A，McCray PB Jr，Chang SM，et al.Proliferation Induced by Keratinocyte Growth Factor Enhances In Vivo Retroviralmediated Gene Transfer to Mouse Hepatocytes［J］.J Clin Invest，1996，98：2683.

［18］Strain AJ，McGuinness G，Rubin JS，et al.Keratinocyte growth factor and fibroblast growth factor action on DNA synthesis in rat and human hepatocytes：modulation by hepar－in［J］.Exp Cell Res，1994，210：253.

［19］Otte JM，Schwenger M，Brunke G，et al.Differential regulated expression of keratinocyte growth factor and its receptor in experimental and human liver fibrosis［J］.Regul Pept，2007，144：82.

［20］Higgins GM，Anderson RM.Experimental pathology of theliver.1.Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal［J］.Arch Pathol，1931，12：186.

［21］An S，Hishikawa Y，Liu J，et al.Lung injury after ischemiareperfusion of small intestine in rats involves apoptosis of type II alveolar epithelial cells mediated by TNF－alpha and activation of Bid pathway［J］.Apoptosis，2007，12：1989.

［22］An S，Soe K，Akamatsu M，et al.Accelerated proliferation of hepatocytes in rats with iron overload after partial hepatectomy［J］.Histochem Cell Biol，2012，138：773.

［23］Tamaru N，Hishikawa Y，Ejima K，et al.Estrogen receptor－associated expression of keratinocyte growth factor and its possible role in the inhibition of apoptosis in human breast cancer［J］.Lab Invest，2004，84：1460.

［24］Nick H，Allegrini PR，Fozard L，et al.Deferasirox reduces iron overload in a murine model of juvenile hemochromatosis［J］.Exp Biol Med（Maywood），2009，234：492.

［25］Bader A，Pavlica S，Deiwick A，et al.Proteomic analysis to display the effect of low doses of erythropoietin on rat liver regeneration［J］.Life Sci，2011，89：827.

［26］Knittel T，Mehde M，Grundmann A，et al.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors during hepatic tissue repair in the rat［J］.Histochem Cell Biol，2000，113：443.

［27］Loyer P，Cariou S，Glaise D，et al.Growth factor dependence of progression through G1 and S phases of adult rat hepatocytes in vitro.Evidence of a mitogen restriction point in mid－late G1［J］.J Biol Chem，1996，271：11484.

［28］Steiling H，Wüstefeld T，Bugnon P，et al.Fibroblast growth factor receptor signalling is crucial for liver homeostasis and regeneration［J］.Oncogene，2003，22：4380.

［29］Li Y，Rinehart CA .Regulation of keratinocyte growth factor expression in human endometrium：implications for hormonal carcinogenesis［J］.Mol Carcinog，1998，23：217.