ELISA法檢測干細胞溶液中殘留牛血清白蛋白含量

宛 瑩，聶德志＊ ，賁 亮，黃若洋

（1.四平中心人民醫院 中心實驗室，吉林 四平 136000；2.吉林省拓華生物科技有限公司，吉林 四平 136000）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于中胚層的具有多向分化潛能的干細胞，是造血微環境中一種重要細胞成分，目前臨床實驗證實間充質干細胞移植可用于組織的修復及治療間充質組織遺傳缺陷性疾病，臨床應用前景廣闊［1－4］。根據2013年國家《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）》的規定，干細胞治療作為一種新型的生物治療產品，所有干細胞制劑都可遵循一個共同的研發過程，即從干細胞制劑的制備、體外試驗、體內動物試驗，到植入人體的臨床研究及臨床治療的過程。整個過程的每一階段，都須對所使用的干細胞制劑在細胞質量、安全性和生物學效應方面進行相關的研究和質量控制。

根據指導原則中的規定，在干細胞的采集、分離及干細胞（系）建立階段，除進行細胞鑒別、成活率及生長活性檢測以外，還應進行全面的內外源致病微生物、詳細的干細胞特性檢測，以及細胞純度分析。其中細胞內外源性細胞因子的檢測項中明確提到如使用過牛血清，須進行牛源特定病毒的檢測包括BSA殘留量檢測。而目前尚無對細胞產品牛血清白蛋白殘留量檢測的標準化方法，主要參照2010年版《中國藥典》三部附錄中牛血清白蛋白殘留量檢測方法的規定進行，采用酶聯免疫法測定供試品中殘余牛血清白蛋白含量。本文采用酶聯免疫法測定細胞不同清洗程序和培養基條件中BSA殘留量的檢測，探討不同清洗程序對細胞產品中BSA殘留量的影響，從而為建立合理有效的清洗程序和檢測標準提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 樣品與試劑

用于檢測的干細胞為臍帶源間充質干細胞，足月剖宮產健康胎兒臍帶，經產婦知情同意及醫院倫理委員會批準，取自四平市中心醫院婦產科，進行常規分離。選用流式細胞儀分析P5細胞檢測表型［5］。BSA殘留量檢測使用試劑盒為無錫博生醫用生物技術開發有限公司的定量檢測牛血清白蛋白（BSA）酶聯免疫試劑盒，批號：20120602。

1.2 試劑 α－MEM 培養 基購自美國 Thermo Fisher公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，無血清培養基購自杭州百通生物科技有限公司。

1.3 方法 干細胞樣品制備見表1。

表1 干細胞樣品制備

1.4 ELISA法檢測BSA殘留的方法 將待測樣品與BSA標準品加入包被有BSA抗體的96孔板中，37℃孵育1小時，洗板并加入酶標記抗體，室溫避光孵育30 min；洗板后加入底物液并避光孵育10－15 min，加入終止液后輕輕震蕩，并在450 nm單波長下讀數。

1.5 統計學處理 實驗重復至少3次，數據用±s表示，多組間均數差異性比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA）。數據采用 Prism 5.0軟件進行分析。

2 結果

h UMSCs自臍帶中分離培養，并傳至P3時形態學上顯示成纖維細胞形態，細胞呈漩渦樣生長。流式細胞術檢測h UMSCs表達CD73，CD90和CD105；不表達 CD34，CD45，CD14，CD19，HLADR［6］。ELISA酶聯檢測試劑盒測定方法計算結果顯示，根據標準濃度繪制標準曲線得到標準方程y＝0.0240x－0.0313，R2＝0.994 1，標準曲線見圖1。使用常規培養基α－MEM 10% 胎牛血清中培養傳至P5時，PBS清洗1次后干細胞溶液中殘留BSA為117.58 ng／ml，PBS清洗3次后干細胞溶液中BSA的殘留量下降為36.60 ng／ml。使用無血清培養基進行細胞培養，樣品中BSA的殘留量隨著細胞的傳代次數至P5時有明顯的減少趨勢，從P3時的95.12 ng／ml下降到P5時的5.96 ng／ml。同時，凍存后的細胞樣品經過復蘇后培養，BSA的殘留為24.65 ng／ml。計算結果見表1。

圖1 根據標準濃度繪制散點圖

表1 根據標準曲線計算得到的測定樣品殘留的BSA含量

3 討論

牛血清是細胞培養和擴增過程中培養液的重要組分，是細胞培養中用量最大的天然培養基，也是許多生物制品保存液中的必要組分之一。在牛血清中，BSA是牛血清中的主要成分（約為35－50 mg／ml），同時也是引起過敏反應的最主要因素之一。BSA，作為異源蛋白的代表，能夠引起機體的多種免疫反應［8－13］。因此，檢測BSA的殘留被作為國家對生物制品質量控制的重要指標。

與其他生物制品不同，細胞產品的純化與清潔只能通過規范的清洗程序，以減低及清除對機體多種不利的影響因素，以達到國家對細胞制品的標準要求。通過本次試驗證實，細胞培養至P5，PBS清洗3次后細胞中BSA殘留量可達到40 ng／ml以內，而且采用無血清培養能從細胞培養的源頭有效地避免BSA的殘留，這對于提高細胞生物制品的生物安全性，推動干細胞生物產品走向規模化及市場化，從而有效地造福人類健康具有重要作用。

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