放療增強對轉染p Ad KDR／CD／TK自殺基因系統的SW480大腸癌細胞的殺傷作用

劉志毅，金 虎，翟春亮，劉 明

（吉林大學第四醫院 普通外科，吉林 長春 130011）

目前對大腸癌的治療，除了外科手術、化療和放療外，生物治療成為研究熱點，其中基因治療研究較多，而自殺基因最為深入。所謂自殺基因就是藥物敏感基因，能夠將無毒的藥物前體在體內轉變成有毒的藥物殺死腫瘤細胞。該療法不但能直接殺傷轉基因的腫瘤細胞，還可利用其獨特的“旁觀者效應”殺傷周圍大量未轉基因的瘤細胞。放射治療是通過輻射誘導腫瘤細胞原發損傷或者細胞凋亡，從而導致腫瘤細胞的死亡。在放療過程中，射線不但殺死腫瘤細胞，同時也會對周圍正常組織造成損害，而且會隨著劑量的增加而加大。研究表明，放射線可以增加基因的轉染率［1，2］，增強基因的穩定表達；而自殺基因可以增加腫瘤的放射敏感性［3］。自殺基因聯合放療治療腫瘤，目前以單自殺基因研究較多，而對雙自殺基因的研究剛剛開始，還比較少。本實驗用以構建的p KDR－CD／TK融合基因，聯合γ射線，進一步探索雙自殺基因與放療對大腸癌SW480細胞的殺傷協同作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

重組腺病毒（recombinant adenovirus with KDR promoder，p Ad Easy－KDR－CD p Ad Easy－KDR－TK p Ad Easy－KDR－CDgly TK）由吉林大學普通外科實驗室構建。DMEM、RPMI 1640、MTT、小牛血清（Gibco公司）；轉染試劑PolyFect（Qiagen公司）；GCV （Roche Pharma 公司），5－FC（Sigma公司）。

1.2 SW480細胞的培養

①于15 ml錐形試管內加入10 ml PRMI1640細胞生長液。②37℃水浴處理冰凍SW480細胞小瓶40－60 s，并輕輕搖動之，室溫下，體積分數70%乙醇浸泡去除污染。③將細胞懸液加入含10 ml PRMI 1640細胞生長液的15 ml錐形試管內，（200×g）離心，5 min，吸除細胞生長液，加入5 ml新鮮細胞生長液。④組織培養瓶，內含新鮮PRMI 1640細胞培養液10 ml，將細胞懸液5 ml加入其中，體積分數5%CO2，37℃孵育；當細胞達到70%匯合時行1∶3傳代。⑤吸除PRMI 1640細胞培養液，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）10 ml清洗細胞，用Tyrosine－EDTA 1 ml消化3 min。⑥用新鮮PRMI 1640細胞生長液8.5 ml滅活Tyrosine，將細胞懸液1 ml加入培養瓶內，在加入新鮮PRMI 1640細胞液9 ml，在體積分數5%CO2，37℃下孵育。⑦細胞70%匯合時傳代。

1.3 p Ad Easy－CDglyTK，p Ad Easy－KDR－CDglyTK重組腺病毒的轉染

先將2份3×105LOVO細胞分別接種于2個10 ml培養皿中，體積分數5%CO2，37℃培養過夜，再分別加入10μl重組腺病毒p Ad Easy－CDgly TK p Ad Easy－KDR－CDgly TK 終 質 量 濃 度 為 mg／L，37℃，體積分數5%CO2培養6 h。之后更換新鮮PRMI 1640細胞培養液，體積分數5%CO2，37℃培養24 h。熒光顯微鏡下觀察轉染效果。

1.4 γ射線對重組腺病毒的SW480細胞感染率的影響

取對數生長期的SW480細胞，以1×104／孔的濃度接種于96孔培養板，體積分數5%CO2，37℃培養過夜，待細胞豐度達約90%，加入不同感染復數（multiplicity of infection，MOI）的目的腺病毒（分別加入10、20、50、100、200、300MOI），加少許培養基振蕩2－3 h后，補足培養基繼續在37℃、5%CO2孵箱內培養，分別用γ射線照射，劑量為1.0Gy，每日照射1 h，分為照射組與對照組，3 d后在熒光顯微鏡下計數GFP陽性細胞百分比。

1.5 60 Coγ射線對轉染重組腺病毒的SW480細胞的殺傷增敏作用

1.5.1 取對數生長期的轉染 p Ad KDR／CD／TK SW480細胞，及對照組SW480細胞（未做任何處置），以2×105／L，接種于96孔板上，每組設3個復孔。共分4組：

γ射線的照射的劑量分別為0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5Gy，GCV濃度為10 mg／l，5－FC濃度為100 mg／l，GCV＋5－FC濃度為10 mg／l＋100 mg／l。然后于37℃、5%CO2培養箱內靜止培養，4 d后MTT法計算細胞生長抑制率。

1.5.2 取對數生長期的轉染p Ad KDR／CD／TK，p Ad KDR／CD，p Ad KDR／TK 的SW480細胞，及對照組SW480細胞（未做任何處置），以2×105／L，接種于96孔板上，每組設3個復孔。共分8組：γ射線的照射的劑量分別為1.0，GCV濃度為10、20、40、60、和100 mg／l；5－FC濃度為：100、200、400、600和1 000 mg／l；GCV＋5－FC濃度為：10＋100、20＋200、40＋400、60＋600和100＋1 000 mg／l。，然后于37℃、5%CO2培養箱內靜止培養，4 d后 MTT法計算細胞生長抑制率。

1.6 細胞克隆形成實驗檢測γ射線增敏作用

將轉染p Ad KDR／CD／TK的SW480細胞用胰酶消化，使細胞呈單個懸浮于培養液中。單個細胞百分率在95%以上，將1×105的細胞接種于6孔板中 ，實驗分為4組：① 對照組；② 單純用藥組（GCV濃度1μg／ml＋5－FC10 g／ml）；③ 單純照射組，給予Coγ射線照射，吸收劑量為400cGy；④ 聯合治療組：先加入1μg／mlGCV＋5－FC10 g／mlG處理，后進行照射，吸收劑量為400cGy，置37℃、5%CO2培養箱培養14 d，用PBS小心清洗2遍，空氣干燥，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，流水緩慢洗去染液，再空氣干燥，顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆。然后按下式計算克隆形成率：克隆形成率（%）＝（克隆數／接種細胞數）×100%；相對克隆形成率（%）＝（照射組克隆形成／對照克隆形成率）×100%。

1.7 統計方法

實驗數據用SPSS11.5軟件處理，采取獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，組間比較用SNK法。

2 結果

2.1 重組腺病毒的PCR鑒定

重組質粒經PCR鑒定，均檢測到目的基因表達（見圖1）。

2.2 γ射線對重組腺病毒對SW480細胞感染率的影響

分為照射組與對照組，3 d后在熒光顯微鏡下計數GFP陽性細胞百分比。結果（圖2）轉染雙自殺基因的大腸癌細胞照射組和對照組轉染率有明顯差異（P＜0.01）。

2.3 前藥對γ射線對轉染重組腺病毒的SW480細胞的殺傷協同作用

2.3.1 轉染p Ad KDR／CD／TK SW480細胞和對照的SW480細胞，均給予GCF＋5－FC和γ射線照射，其生長率如圖3。γ射線0.2Gy時，生存率分別為（32.2±4.3）%和（86.6±4.6）%；γ射線0.5Gy時，生存率分別為（11.3±3.1）%和（75.2±4.8）%；γ射線0.8Gy時，生存率分別為（6.5±1.4）%和（68.8±5.2）%；γ射線1.0Gy時，生存率分別為（1.6±0.3）%和（47.2±3.7）%；γ射線1.5Gy時，生存率分別為（0.2±0.06）%和（33.9±2.4%）；提示轉染p Ad KDR／CD／TK SW480細胞比對照組對前藥＋γ射線更為敏感（各組P＜0.001）。

2.3.2 取對數生長期的轉染p Ad KDR／CD／TK，p Ad KDR／CD，p Ad KDR／TK的SW480細胞，及對照組SW480細胞（未做任何處置），分別給予不同濃度GCV、5－FC及 GCV＋5－FC。MTT法計算細胞生長抑制率。結果（圖4）：TK＋CD／G＋F組和TK＋CD／G＋F＋γ組比較，前藥為10／100時細胞生長率分別為（87.4±5.2）%和（31.2±3.8）%；20／200時細胞生長率分別為（64.9±5.6）%和（23.5±4.1）%；40／400時細胞生長率為（56.2±4.8）%和（19.7±3.2）%；60／600時分別為（33.1±2.6）%和（2.1±0.2）%；100／1000時分別為（20.9±2.3）%和（1.3±0.3）%。兩組比較有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 細胞克隆形成實驗檢測γ射線增敏作用

見表1。單純用藥組和對照組比較有統計學意義（P＜0.01）。聯合治療組和單純用藥組比有顯著差異（P＜0.0005）。而聯合治療組（G＋F）與單純放射組比相對克隆率分別為16.8%和59.6%，聯合用藥（G＋F）與單藥（G）、（F）的相對克隆形成率分別為16.8%和43.8%、46.0%。提示γ射線對聯合應用GCV＋5－FC比單獨應用GCV或5－FC具有明顯的曾敏作用；TK／CD雙自殺基因的曾敏作用明顯高于單自殺基因TK或CD（P＜0.001）。

3 討論

研究表明，自殺基因對大腸癌細胞具有殺傷作用［4－8］，Takeharu kanazawa等［9］報道 γ射線照射能夠增強TK／GCV在癌細胞中的轉染率和表達。本實驗利用已構建的Adp KDR－TK／CD腺病毒載體，轉染大腸癌SW480細胞，給予前藥聯合γ射線照射，觀察雙自殺基因和γ射線照射的協同增效作用。①轉染率：用不同的MOI轉染SW480細胞，并用γ射線1Gy照射，當MOI值為10、20、50時對照組分別是對照組的10.2倍、5.5倍、2.1倍，說明γ射線照射能明顯提高雙自殺基因的轉染效率，并且MOI值較低時作用明顯。其原理可能是因為輻射使受照細胞表面受損及穿孔，引起細胞膜通透性和跨膜電位的改變，便于帶負電荷的外源基因主動進人細胞，隨著輻射劑量的增加細胞內基因產物的量也相應增加。再有輻射導致受體細胞DNA損傷，從而激活細胞的修復機制，在修復過程中由于剪切和重組的發生，很容易使外源DNA和受體DNA發生重組整合。Stevens等［10］發現用9Gy的γ射線照射可以將質粒載體介導的DNA的初始轉染效率提高1400倍。雖然本實驗γ射線量較小，但轉染率提高也很明顯。②自殺基因＋前藥對γ射線的增敏作用：轉染 p Ad KDR／CD／TK SW480 細 胞／γ 組 和 轉 染p Ad KDR／CD／TK SW480細胞／GCV＋5－FC＋γ組相比，分別給予 GCV／5－FC100μg／ml＋1 000μg／ml，當γ射線0.2Gy、0.5Gy、0.8Gy、1.0Gy、1.5Gy其細胞生存率前者分別是后者的2.6倍、5.6倍、7.6倍、20.3倍和141.5倍。其可能的機制是輻射使受照細胞基因轉染率升高，DNA受損、斷裂，并且射線對處于G1期細胞殺傷作用強，而5－FU對于處于S期的細胞殺傷作用明顯；放療可使藥物從受到損傷的細胞中釋放出來，因而強化了基因治療的“旁觀者效應”。③γ射線對自殺基因的增敏作用：TK＋CD／G＋F組和TK＋CD／G＋F＋γ組比較，給予γ射線1.0Gy照射，并給予前藥GCV＋5－FC分別為10μg／ml＋100μg／ml、20μg／ml＋200μg／ml、40μg／ml＋400μg／ml、60μg／ml＋600μg／ml、100 μg／ml＋1 000μg／ml。兩組比較前者的細胞生存率是后者的2.8倍、2.8倍、2.8倍、16倍、16倍。提示自殺基因對γ射線的增敏作用，其機制可能是：前藥改變腫瘤細胞敏感性，主要是通過促進促凋亡基因bax的轉錄、抑制凋亡基因bcl－2的轉錄，以增強腫瘤細胞對放療的敏感性；或者使腫瘤細胞阻滯于G1期，而G1后期對放療敏感，從而提高腫瘤細胞對輻射的敏感性，磷酸化的前體藥物攙入DNA中可干擾放射損傷的修復，還可對抗放療后腫瘤細胞的再增殖。

表1 SW480細胞克隆形成率與相對克隆形成率

綜上所述，通過本實驗提示我們，自殺基因聯合放療：① 放射線可提高基因轉移的效率［11］，因而提高了基因治療的效果。② 磷酸化的前體藥物攙入DNA中可干擾放射損傷的修復。③ 放療可使藥物從受到損傷的細胞中釋放出來，因而強化了基因治療的“旁觀者效應”。④ 基因治療可增強放療的療效 ，例如直接殺傷或抑制，腫瘤細胞的基因治療聯合放療不但能提高腫瘤細胞的殺傷能力，還可對抗放療后腫瘤細胞的再增殖，從而提高療效。⑤ 基因治療可增強放療的療效，提高其放射敏感性，減少前藥的用量，降低射線照射的劑量，可減輕前藥的副作用和正常組織的放射性損傷，為提高放療療效提供了可能性。

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