多次小劑量STZ處理建立糖尿病大鼠模型及EGF與Gastrin聯(lián)合應用對胰島素分泌的影響

孟召祥，高 靜，張俊輝，劉靜秋，楊 麗，倪勁松＊

（1.吉林省人口生命科學技術(shù)研究院，吉林 長春 130041；2.吉林大學第一醫(yī)院 病理科，吉林 長春 130021；3.吉林大學人獸共患病教育部重點實驗室 人獸共患病研究所，長春 130062；4.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院）

2型糖尿病患者早期具有胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷的雙重因素，但不少患者在疾病晚期也出現(xiàn)胰島素分泌嚴重不足，需要外源性胰島素治療。糖尿病患者不但遭受胰島素注射所帶來的不便和痛苦，而且不能完全控制血糖穩(wěn)定并避免遠期并發(fā)癥的發(fā)生。EGF與Gastrin聯(lián)合應用可增加STZ誘導的糖尿病大鼠胰島中的β細胞數(shù)量，降低血糖［1］，并能使四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的血糖恢復正常［2］。Wilma L等發(fā)現(xiàn)EGF與Gastrin短期應用即可使自發(fā)性糖尿病NOD鼠的胰島細胞群數(shù)量增多，并且逆轉(zhuǎn)NOD鼠的高血糖狀態(tài)［3］。本文采用小劑量STZ多次誘導糖尿病大鼠模型，通過免疫熒光和生化檢測技術(shù)，分析EGF與Gastrin聯(lián)合應用對糖尿病大鼠模型胰腺功能的影響。

1 材料和方法

1.1 糖尿病模型動物制備

清潔級健康 Wistar雄性大鼠48只，體重180 g－220 g，由本校基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物中心提供（中心許可證號：SCXK吉2003－001）。大鼠隨機分為兩組，其中實驗組35只，對照組13只。實驗組大鼠按照35 mg·Kg－1腹腔注射STZ－枸櫞酸鈉緩沖液，每周1次，連續(xù)4周。對照組大鼠給予p H4.0枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射，鼠尾采血測試血糖，以最后一次檢測血糖值≥11.1 mmol·L－1和尿糖≥ ＋＋＋為成模標準。計算大鼠成模率及存活率，評估造模效果。

1.2 實驗分組

將29只實驗組成模大鼠隨機分為三組，即：Insulin治療組10只，EGF／Gastrin聯(lián)合治療組10只及DM對照組9只，另設正常對照組大鼠10只。EGF／Gastrin組給予 EGF（1μg·Kg－1）／Gastrin（3μg·Kg－1），每日1次皮下注射，連續(xù)14日；Insulin組給予長效胰島素2 U／d，連續(xù)14日；DM對照組及正常對照組給予p H8.0 Tris－cl緩沖液。

1.3 實驗檢測指標

（1）大鼠一般情況：給藥期間觀察大鼠飲水量、尿量、體重變化及一般狀態(tài)。

（2）空腹血糖值：所有動物處死前禁食不禁水8 h，鼠尾靜脈采血檢測空腹血糖值。

（3）血清胰島素及C肽含量：實驗動物麻醉后腹主靜脈取血，離心后分離上層血清，放射免疫法檢測大鼠血清胰島素及C肽含量，評估胰島功能。

（4）胰島中Insulin陽性表達細胞的變化

各組大鼠處死后，取胰腺于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片。免疫熒光染色檢測Insulin表達情況。激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，分析不同實驗組大鼠胰腺Insulin陽性細胞數(shù)量及熒光強度的變化，評估胰島功能及損傷恢復情況。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)以±s表示，各組間數(shù)據(jù)根據(jù)比較對象不同分別采用方差分析，q檢驗。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠糖尿病模型的建立

實驗組大鼠注射STZ1周后，少數(shù)出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，4周后表現(xiàn)尿量明顯增加，并出現(xiàn)多飲多食。實驗組大鼠沒有出現(xiàn)死亡。每周體重檢測結(jié)果顯示實驗組大鼠體重相對于正常對照組大鼠體重上升趨勢減緩。4次注射STZ后24 h，禁食8 h鼠尾采血法檢測大鼠空腹血糖值。35只實驗組大鼠中有33只血糖值≥11.1 mmol·L－1，占總數(shù)的94%。33只達到成模標準的實驗組大鼠的平均血糖值為15.6±3.01 mmol·L－1，較正常對照組顯著增高，見表1（P＜0.05）。腹腔注射STZ4周，每周檢測大鼠尿糖變化。第1、2、3、4周出現(xiàn)尿糖陽性3＋及以上的累計數(shù)量分別為6只，12只，20只，32只。分別占總數(shù)的17%、34%、57%、91%。根據(jù)成模標準，選取空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1同時尿糖陽性3＋及以上的實驗組大鼠為糖尿病模型大鼠，共32只，成模率為91%。

表1 實驗大鼠血糖值變化

組織學結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，正常大鼠胰島為橢圓形或圓形細胞團，數(shù)量較多，均勻分布于胰腺腺泡之間。鏡下觀察胰島結(jié)構(gòu)清晰，無淋巴細胞浸潤。而成模大鼠的胰島數(shù)量明顯減少，分布不均勻并出現(xiàn)不同程度的萎縮，胰島β細胞數(shù)量明顯減少并出現(xiàn)空泡變性，胰島空虛。胰島內(nèi)可見以淋巴細胞、單核細胞為主的炎性細胞浸潤（圖1）。Insulin免疫組織化學染色結(jié)果顯示，成模大鼠胰島內(nèi)Insulin染色陽性的細胞明顯減少；且殘存胰島β細胞Insulin染色強度低于正常對照組（圖2），提示注射STZ后，胰島出現(xiàn)明顯的損傷，胰島β細胞被破壞、減少，殘存的β細胞Insulin合成功能下降。

圖1 HE染色檢測胰島破環(huán)情況

圖2 免疫組織化學染色檢測Insulin表達

2.2 EGF與Gastrin聯(lián)合應用對糖尿病大鼠模型胰腺功能的影響

連續(xù)14天外源性胰島素治療后，間隔12小時鼠尾靜脈采血測量空腹血糖值。結(jié)果顯示10只Insulin組大鼠中有8只血糖值低于11.1 mmol·L－1，其中6只低于7.8 mmol·L－1，平均血糖值為8.0±4.38 mmol·L－1。EGF／Gastrin組大鼠中6只血糖值低于11.1 mmol·L－1，其中5只低于7.8 mmol·L－1，平均血糖值為11.2±6.43 mmol·L－1。DM組大鼠的血糖值隨著時間的推移變化較大。最高值為26.1 mmol·L－1，平均值為20.3±3.78 mmol·L－1。Insulin組大鼠血糖值同DM 組相比顯著降低（P＜0.05）。EGF／Gastrin組大鼠血糖值同DM組相比顯著降低（P＜0.05），但仍高于正常對照組與Insulin組（表2）。

表2 實驗大鼠4次STZ注射前后空腹血糖值變化

2.3 血清胰島素含量及C肽含量變化

各組大鼠腹主靜脈取血，離心分離血清，放射免疫法檢測血清胰島素含量及C肽含量。統(tǒng)計結(jié)果顯示，DM組中血清胰島素及C肽含量顯著低于正常對照組（P＜0.05），而Insulin組及EGF／Gastrin組均顯著高于DM組（P＜0.05）。說明Insulin及EGF／Gastrin聯(lián)合應用均能促進糖尿病大鼠胰島素的分泌（表3）。

表3 血清中胰島素及C肽含量

2.4 胰島β細胞Insulin表達變化

各組大鼠胰腺組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后，采用免疫熒光染色法檢測Insulin表達情況。結(jié)果顯示在正常大鼠胰島中，Insulin陽性細胞分布均勻；DM組大鼠胰島中僅有少數(shù)幾個殘存的β細胞表達Insulin，且表達強度明顯低于正常對照組，與DM組比較，Insulin組及EGF／Gastrin組大鼠胰島中Insulin表達細胞明顯增多，有部分細胞呈強陽性表達（圖3）。

圖3 免疫熒光染色檢測不同實驗組中Insulin表達情況

3 討論

傳統(tǒng)的糖尿病模型復制方法，一般采用一次性大劑量注射STZ（＞60 mg／kg）誘導急性糖尿病的發(fā)生，注射72小時后血糖可穩(wěn)定升高，動物出現(xiàn)三多一少的癥狀。但動物死亡率高，且STZ集中大量破壞β細胞，使糖尿病很快發(fā)生，短期內(nèi)即達到糖尿病的臨床癥狀期，與發(fā)生在自身免疫性胰島炎基礎(chǔ)上的糖尿病在病程及發(fā)病機制方面存在較大差異，即免疫因素參與發(fā)病的特點不能被該模型所模擬。目前，較多學者開始致力于多次小劑量注射STZ誘導糖尿病模型的研究。一般認為，小劑量STZ注射可破壞少量β細胞，死亡的β細胞作為抗原被巨噬細胞吞噬，產(chǎn)生TH1刺激因子（IL－12），使TH1細胞占優(yōu)勢而產(chǎn)生IL－2及氧自由基NO、H2O2等，殺傷少量β細胞，并誘導細胞凋亡，死亡細胞再次以自身抗原釋放，并呈遞給APC細胞進行處理，釋放細胞因子，放大細胞的損傷效應，最終導致糖尿病的發(fā)生［4，5］。

在本實驗中，采用35 mg·Kg－1STZ腹腔注射，每周1次，連續(xù)4周，誘導雄性Wistar大鼠糖尿病模型，并對模型建立后大鼠的一般狀況、體重、血糖及尿糖等進行檢測，對其死亡率進行統(tǒng)計進而評價造模效果。結(jié)果顯示：首次注射STZ 1周后，少數(shù)大鼠出現(xiàn)多尿現(xiàn)象。4次注射后STZ誘導的糖尿病模型鼠表現(xiàn)出明顯的糖尿病癥狀和病理改變。表現(xiàn)為飲水量、進食量及尿量明顯增加，毛色失去光澤，鼠精神狀態(tài)差，血糖、尿糖水平明顯升高；病理學檢測發(fā)現(xiàn)β細胞數(shù)量明顯減少，呈現(xiàn)淋巴細胞浸潤的胰島炎改變。4次STZ注射后實驗組大鼠沒有出現(xiàn)死亡，每周體重檢測結(jié)果顯示實驗組大鼠體重較對照組大鼠體重上升趨勢減緩。第4次注射STZ后24小時，鼠尾靜脈采血檢測大鼠血糖，94%的大鼠血糖值≥11.1 mmol·L－1。而且血糖持續(xù)在較高水平為出現(xiàn)波動。每周檢測大鼠尿糖變化，發(fā)現(xiàn)尿糖＋＋＋以上的鼠隨注射STZ次數(shù)的增加而增多。這一現(xiàn)象說明單次給藥時較難出現(xiàn)糖尿病的臨床癥狀，可能因為此時β細胞破壞較少未達到失代償水平，或者殘存β細胞發(fā)生代償而致糖尿病臨床癥狀不明顯。隨著STZ累積劑量的增加，β細胞被大量破壞并釋放自身抗原，不斷強化自身免疫反應，破壞免疫抑制機制，最終導致穩(wěn)定持久的糖尿病的發(fā)生。且本實驗模型建立過程中無大鼠死亡，說明多次小劑量STZ注射可明顯降低實驗動物的死亡率，在動物模型存活方面占有明顯優(yōu)勢。可見，小劑量多次注射STZ誘導的糖尿病模型可有效模擬人類糖尿病的發(fā)病機制及病程，并且動物成模率高、死亡率低，模型穩(wěn)定。是糖尿病研究較理想的動物模型。

胚胎時期胰島前體干細胞在多種生長因子的刺激下最終發(fā)育為成熟的β細胞；成體的胰腺組織在發(fā)生胰腺炎或胰腺損傷后，胰腺修復再生過程中同樣出現(xiàn)表皮生長因子（EGF）等生長因子的表達增加。我們通過對血糖、血清胰島素及C肽的檢測發(fā)現(xiàn)，EGF／Gastrin治療組大鼠的血糖明顯低于糖尿病大鼠，但其仍然高于正常組大鼠。血清胰島素和C肽水平顯著高于糖尿病組大鼠。說明給予EGF／Gastrin聯(lián)合治療后大鼠的胰島功能有所恢復并開始合成內(nèi)源性胰島素。

EGF／Gastrin聯(lián)合治療糖尿病的作用機制尚不明確。有人認為 給予EGF／Gastrin后可導致胰島β細胞群增多，其分泌的胰島素足以維持血糖的正常水平［6］。也有資料表明，發(fā)生了糖尿病的NOD鼠給予EGF／Gastrin短期治療后即可導致β細胞數(shù)目的增多及胰島素含量的增加，并能降低胰島炎性反應，逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)，這些改變伴隨著免疫調(diào)節(jié)細胞的參與［7－9］。因此認為，EGF／Gastrin聯(lián)合應用在抑制自身免疫性β細胞破壞的同時可誘導β細胞再生。

［1］Fosgerau K，Jessen L，Lind Tolborg J.The novel GLP－1－gastrin dual agonist，ZP3022，increasesβ－cell mass and prevents diabetes in db／db mice［J］.Diabetes Obes Metab，2013，15（1）：62.

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［3］Rooman，L.J.Lardon，D.Flamez，F(xiàn).Schuit ＆ L.Bouwens：Mitogenic effect of gastrin and of gastrin reoeptors in duct－like cells of rat pancreas［J］.Gastroenterology，2001，121：940.

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［5］Zheng XX，Steele AW，Hancock WW，et al.A nomcutolytic IL10／Fc fusion protein prewents diabetes，blocks autoimmunity，and peomotes suppressor phenomena in NOD mice［J］.Immunol，1997，158：4507.

［6］Wilma L.Suarez－Pinzon，Jonathan R.T.Lakey，et al.Combination Therapy with Epidermal Growth Factor and Gastrin Induces Neogenesis of Huaman Isletβ－Cells from Pancreatic Duct Cells and an Increase in Functionalβ－Cell Mass［J］.Dlabetes，september 2005，54.

［7］Wilma L.Suarez－Pinzon，Yanhua Yan，et al.Combination Therapy With Epidermal Growth Factor and Gastrin Increasesβ－Cell Mass and Reverses Hyperglycemia in Diabetic NOD Mice［J］.Diabetes，Vol.54，September 2005.

［8］Suarez－Pinzon WL，Lakey JR，Rabinovitch A.Combination therapy with glucagon－like peptide－1 and gastrin induces beta－cell neogenesis from pancreatic duct cells in human islets transplanted in immunodeficient diabetic mice［J］.Cell Transplant，2008，17（6）：631.

［9］Suarez－Pinzon WL，Rabinovitch A.Combination therapy with a dipeptidyl peptidase－4 inhibitor and a proton pump inhibitor inducesβ－cell neogenesis from adult human pancreatic duct cells implanted in immunodeficient mice［J］.Cell Transplant，2011，20（9）：1343.