結核分枝桿菌的實驗室檢測方法學評價及耐藥情況分析

李寧，伍嚴安，胡辛蘭，吳長生

(福建省立醫院檢驗科，福建福州350001)

結核分枝桿菌的實驗室檢測方法學評價及耐藥情況分析

李寧，伍嚴安，胡辛蘭，吳長生

(福建省立醫院檢驗科，福建福州350001)

目的比較結核分枝桿菌的3種實驗室檢測方法,了解出國體檢人群結核分枝桿菌的檢出率及耐藥情況。方法收集2010年1月至2012年12月福建省立醫院出國體檢中心1030例疑似結核病患者的3090份標本的涂片鏡檢，羅氏固體培養，MGIT 960液體培養等3種實驗室檢測方法的結果，并對藥敏情況進行分析。結果3種方法中，涂片鏡檢法檢測時間最短(2h)，但陽性率最低(2.0%)；羅氏固體培養陽性檢測時間最長(21.4d)，陽性率為7.1%，污染率2.1%；MGIT 960液體培養陽性檢測時間為11.2d，陽性率為9.2%，污染率4.3%。106株結核分枝桿菌中，74株對5種抗結核一線藥物全部敏感，耐吡嗪酰胺(PZA)的有25株，耐異煙肼(INH)的有13株，耐鏈霉素(SM)的有9株，耐利福平(RFP)的有4株，沒有出現耐乙胺丁醇(EMB)的菌株。結論結核分枝桿菌的實驗室檢測方法中，MGIT 960液體培養時間較短，陽性率最高。在5種抗結核一線藥物中，對PZA的耐藥率最高，其次是INH。

結核病；分枝桿菌屬；檢測；評價；耐藥性

被稱為白色瘟疫的結核病是一種嚴重威脅人類健康的傳染病。據WHO的最新報告，2010年有大約880萬例新發結核病，145萬例死于結核病[1]。結核病診斷的理想方法應是快速、特異、敏感，廣大地區和人群可以接受，能辨別結核分枝桿菌和環境中的非結核分枝桿菌，且不需昂貴儀器和專業培訓的方法[2]。目前，國內結核病主要的實驗檢測方法包括涂片鏡檢法、羅氏固體培養法、液體培養法、PCR基因檢測法等，其中涂片鏡檢和分枝桿菌的培養是結核病臨床診斷與鑒別的金標準[3]。提高結核病的檢測速度，縮短藥敏結果的報告時間，對于結核病的早期診斷和合理用藥具有重要意義。福建省立醫院是福建省最大的綜合性醫院，同時擔負著美國、加拿大及澳洲出國人員結核病的篩查、診斷及治療任務。筆者收集了2010年1月至2012年12月福建省立醫院出國體檢中心1030例疑似結核病患者的3090份標本的結核菌的涂片、培養和藥敏結果，現分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料福建省立醫院2010年1月至2012年12月出國體檢中心1030例疑似結核病患者的3090份痰標本(每位患者都連續送3次)，其中男性患者575例，女性患者455例。

1.2 儀器和試劑BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養儀，由美國BD公司生產，其配套試劑包括分枝桿菌液體培養管(MGIT培養管)、生長添加劑、雜菌抑制劑(PANTA)、分枝桿菌聯合藥敏試劑盒(SIRE kit)和PZA藥敏試劑盒。化學發光檢測儀LEADER 50I、AccuProbe探針檢測試劑盒及羅氏培養基由梅里埃公司生產。Mtb抗原檢測試劑(膠體金法)由杭州創新生物檢驗技術公司生產。抗酸染液、革蘭染液購自貝索公司。標本前處理液：4%N-乙酰-L半胱氨酸-氫氧化鈉(4%NALCNaOH)，pH6.8磷酸鹽緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 標本前處理步驟按BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統操作指南完成，取沉渣0.5ml接種于MGIT培養管，同時取沉渣0.2ml接種于中性羅氏培養基，并進行涂片，待涂片自然干燥后進行抗酸染色，統計其初始涂片陽性率。

1.3.2 藥敏試驗采用比例法，藥敏操作按照BACTEC MGIT 960操作指南完成。BACTEC MGIT 960能進行鏈霉素(SM)、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PZA)五種一線抗結核藥物的敏感性實驗，藥物終濃度分別為1.0、0.1、1.0、5.0和100μg/ml。藥敏質量控制菌株為H37RV。

1.3.3 檢出陽性結果的處理BACTEC MGIT 960儀器報告陽性后，取出陽性培養管，做兩張涂片，分別行抗酸染色和革蘭染色。若抗酸染色陽性，視為分枝桿菌生長；若抗酸染色陰性，需再行普通細菌培養和革蘭染色，確定是否有其它細菌或真菌生長，若有即視為標本污染。中性羅氏培養基置于37℃溫箱中孵育，每周觀察兩次，若發現可疑菌落，處理及判斷同BACTEC MGIT 960培養。BACTEC MGIT 960培養周期為42d，超過42d未報陽視為陰性；中性羅氏培養基培養周期為56d，超過56d未報陽視為陰性。

1.3.4 菌型鑒定若涂片證實為分枝桿菌生長，即取培養管中的培養物100μl，加于膠體金檢測條中，15min后觀察結果，陽性說明為結核分枝桿菌。同時用Gen-Probe分子生物學診斷的AccuProbe探針檢測試劑盒，完成結核與非結核分枝桿菌的檢測和鑒定。

1.3.5 藥敏結果判讀聯合藥敏SM、INH、RFP和EMB 4種藥物共用1個生長對照管，對照管作1: 100稀釋。PZA藥敏采用PZA專用培養管，對照管作1:10稀釋。當生長對照管的生長單位(GU)≥400時，評價含藥物的培養管，如果含藥物的培養管GU≥100，則結果判為耐藥，如果GU＜100，則結果判為敏感。

2 結果

2.1 結核菌3種實驗診斷方法的平均時間、陽性率和污染率的比較，見表1。

表1 結核菌3種實驗診斷方法的平均時間、陽性率和污染率比較

2.2 106株結核菌藥敏結果見表2。

表2 106株結核菌藥敏結果

3 討論

分枝桿菌是一類抗酸陽性的細長略帶彎曲的桿菌，有時呈分枝狀。根據致病性的不同，分為結核分枝桿菌群和非結核分枝桿菌群。結核分枝桿菌是結核病的病原菌，能夠導致進行性疾病和無癥狀的潛伏感染。本菌可侵犯全身各組織器官，以肺部感染最為多見。目前檢測分枝桿菌的方法有涂片鏡檢法、羅氏固體培養法、液體培養法和PCR檢測法等。其中，分枝桿菌的涂片鏡檢與培養是結核病診斷的金標準。

涂片鏡檢法方法快速簡單，但敏感性較低，痰標本含菌量達104/ml方能檢出[4]。從表1可以看出，涂片鏡檢雖然所用時間最短，但陽性率僅達到2%，明顯低于固體培養的7.1%和液體培養的9.2%。涂片鏡檢法的陽性率與標本的質量密切相關，且一般要求連續送檢3d，以提高檢出率。另外，涂片鏡檢法無法開展菌型鑒定及藥敏試驗，因此有很大的局限性。

由于分枝桿菌生長速度緩慢，18h分裂一次，故分枝桿菌的培養時間較長。分枝桿菌的培養基有改良的羅氏固體培養基和液體培養基。從表1可以看出，液體培養的時間比固體培養的時間明顯縮短，但液體培養需要昂貴的儀器設備，基層醫院很難開展。液體培養的陽性率高于固體培養，但污染率相對較高，這可能與前處理液中的氫氧化鈉濃度有關。

固體或液體培養基培養出分枝桿菌后，必須對培養物進行進一步的菌型鑒定。目前我院采用的是簡便快速的膠體金法，同時用通過美國FDA認證的Gen-Probe分子生物學診斷的AccuProbe探針檢測法進行驗證。283株分枝桿菌的菌型鑒定結果顯示，結核分枝桿菌占152株，非結核分枝桿菌占131株。膠體金法和AccuProbe探針檢測法的符合率為100%。膠體金法方便快捷，結果準確，可以作為結核菌菌型鑒定的首選方法。

經膠體金法和AccuProbe探針檢測法的聯合檢測，我院對檢出的152株結核分枝桿菌中的106株(剔除了重復菌株)進行了藥敏實驗，結果顯示：106株結核分枝桿菌中，對5種抗結核一線藥物全敏感的有74株，占69.8%；耐藥的有32株，占30.2%，低于國家調查公布的46%的全國平均耐藥水平[5]。其中耐PZA的比例最高，達到23.6%，高于昆明蘇俊華等人報告的10.1%[6]。其次是INH,占12.3%，EMB的敏感性最好，耐藥率為0。對MDRTB也做了統計，僅占2.8%，比例較低，這可能與受檢群體為疑似結核的出國體檢人員有關，這些患者一般都是首次發現，大部分還沒有經過治療。

通過對疑似結核的出國體檢人員的結核分枝桿菌培養的各項數據的統計分析，我們對這一群體的陽性檢出率及藥敏耐藥率等有了初步的了解，積累了一定的經驗，這對出國體檢人員這一群體結核病的檢出與防治具有重要意義。

[1]Global Tuberculosis control:WHO report 2011[EB/OL].2011.http:// www.who.int/tb/publications/global-report/en.

[2]Rosenkrands I,Aagaard C,Weldingh K,et al.Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis[J].Tuberculosis,2008,88(4):335-343.

[3]張思潮,邱志紅,陸惠勤.不同痰液標本肺結核桿菌培養結果比較[J].浙江預防醫學,2008,20(1):59．

[4]熊禮寬.結核病實驗診斷學[M].北京:人民衛生出版社,2003：92-135.

[5]葉鶯,嚴延生.耐多藥結核病的流行概況[J].疾病控制雜志,2008,13 (1):63-65.

[6]蘇俊華,梁桂亮,保凌.昆明地區結核分枝桿菌標本培養檢測及耐藥情況分析[J].中國防澇雜志,2012,34(1):32-35.

Evaluation of three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis and analysis of drug resistance in isolates

LI Ning,WU Yanan,Hu Xinlan,et al.Department of Clinical Laboratory,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China

Objective To compare three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis and analyze the distribution and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis isolated from personnel going abroad.Methods The results of 3090 samples from 1030 personnel going abroad with suspected tuberculosis in Fujian provincial hospital from 2010 to 2012 were collected and analyzed,which were detected by smear-microscopy method,Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method.The results of the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis were analyzed too.Results Among the smear-microscopy,Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method,the detection times of them were 2 hours,21.4 days and 11.2 days respectively;the positive rates of them were 2.0%,7.1%and 9.2%respectively,the contamination rates of Roche solid culture and MGIT960 liquid culture method were 2.1%and 4.3%respectively.In total 106 strains of Mycobacterium tuberculosis,the number of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to Pyrazinamide,Isoniazid,Streptomycin and Rifampin were 25,13,9 and 4,respectively;all strains were sensitive to Ethambutol;and 74 strains were sensitive to all five drugs.Conclusions Among three methods in the detection of Mycobacterium tuberculosis,the MGIT 960 liquid culture method is the best,which spends the least time and has the highest positive rate.Among five mainly used anti-tuberculosis first-line drugs,the top two levels of drug resistance to Mycobacterium tuberculosis were Pyrazinamide and Isoniazid.

Tuberculosis;Mycobacterium;Detection;Evaluation;Drug resistance

R446.5，Q939.92，R378.91+1，R52

A

1674-1129(2013)03-0214-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.005

李寧，女，1974年12月出生，畢業于福建醫科大學檢驗系，學士學位。主管技師，從事臨床微生物的檢驗與研究。