探討外周血hnRNP A2/B1診斷非小細胞肺癌的臨床意義

龍穎穎，古艷，李羲，顏春松，都莉

(1、南昌大學第二附屬醫院，江西南昌330006；2、南昌大學第三附屬醫院，江西南昌330006；3、海南醫學院附屬醫院)

探討外周血hnRNP A2/B1診斷非小細胞肺癌的臨床意義

龍穎穎1，古艷2，李羲3，顏春松1，都莉2

(1、南昌大學第二附屬醫院，江西南昌330006；2、南昌大學第三附屬醫院，江西南昌330006；3、海南醫學院附屬醫院)

目的探討外周血異質性胞核核糖蛋白A2/B1(Heterogeneous nuclear ribnucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)對非小細胞肺癌臨床診斷意義，并分析吸煙對hnRNP A2/B1表達的影響。方法將2009年1月至2012年6月于南昌大學第二附屬醫院行肺腫塊切除術41例非小細胞癌患者分成Ⅰ-Ⅱ期肺癌組17例、Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組24例，此外隨機取肺部良性病變30例為對照組；又根據是否吸煙分成吸煙組34例，不吸煙組37例。抽提71例患者外周血及肺組織hnRNP A2/B1 mRNA,采用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)技術，分析3組患者hnRNP A2/B1 mRNA在外周血及病變肺組織的表達差異；并分析吸煙對外周血及肺組織hnRNP A2/B1表達影響。結果hnRNP A2/B1在非小細胞肺癌患者外周血及病變肺組織中表達無顯著性差異(P＞0.05),在兩肺癌組患者外周血及肺組織的表達較良性病變組顯著升高，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01);吸煙組hnRNP A2/B1基因表達較不吸煙組升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論檢測外周血hnRNP A2/B1診斷非小細胞肺癌具有一定臨床意義；吸煙可能是誘導機體hnRNP A2/B1基因表達上調的因素。

異質性胞核核糖核蛋白A2/B1；非小細胞肺癌；吸煙

隨著全球大氣污染日趨嚴重，肺癌的發病人數和死亡人數逐年升高，發病率和死亡率高居所有腫瘤之首。肺癌診斷后5年生存率很低，早期診斷可以使I期腫瘤患者的5年生存率達到80%，因此早期診斷肺癌對提高患者生存率是至關重要的。目前早期診斷肺癌的方法有限，隨著的分子生物學的發展，很多學者致力于腫瘤標志物的研究，現在已發現10余種與肺癌相關的腫瘤標志物[1]。hnRNP A2/B1是一種癌生長蛋白，與非小細胞肺癌的發生發展密切相關[2,3]，本研究采用RT-PCR技術，分析hnRNP A2/B1基因在肺部良性疾病和非小細胞肺癌患者的外周血及肺病變組織的表達差異，探討其在非小細胞肺癌診斷中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料71例患者于2009年1月至2012年6月來我院胸外科行肺部包塊切除術，術前未行化療及相關手術治療，術后經細胞學(和)或病理組織學檢查，其中Ⅰ期～Ⅱ期肺癌組17例：鱗癌12例，腺癌5例；男9例，女8例。平均年齡：61.58± 15.63歲。Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組24例：鱗癌14例，腺癌7例，大細胞癌2例，肉瘤1例；男14例，女10例，平均年齡：60.13±16.39歲。肺良性病變組30例：錯構瘤14例，肺炎性假瘤5例，纖維瘤3例，其它8例；男19例，女11例，年齡51.57±23.83歲。71例患者依據WHO 1984吸煙調查方法標準化即每天吸煙1支以上，時間長于1年為吸煙者的建議分吸煙組34例，不吸煙組37例。

1.2 方法

1.2.1 外周血及肺病變組織RNA提取及逆轉錄反應(1)外周血RNA獲取：術前抽取2ml外周血TRIzol法提取總RNA。(2)手術獲得肺病變組織約100mg，用含1‰DEPC的PBS(pH7.4)洗盡肺組織的血液，TRIzol法抽提肺組織RNA。取上述RNA 10μl，0.05μg/μl Oligo(dT)15 Primer 2μl及無核酶水2μl混勻，然后加入5×M-MLV Buffer 5μl、MMLV 1μl、RNasin 0.5μl、dNTP 1μl及無核酶水3.5μl混勻，用帶熱蓋的PCR儀42℃60min轉錄成cDNA產物。

1.2.2 引物設計Oligo 6設計引物序列詳見表1，以hnRNP A2/B1基因的cDNA為模板設計一對上游和下游引物，擴增片段280bp。此外，為檢測RNA提取效果及擴增效率以β-actin為內參設計一對引物，擴增片段600bp。

表1 引物序列

1.2.3 PCR反應及產物分析將cDNA進行hn-RNP A2/B1和β-actin的PCR反應。具體操作：(1) cDNA模板5.0μl，hnRNP A2/B1 Primer(10μM) 1.0μl，β-actin Primer(10μM)1.0μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 5.5μl共計25μl反應體系。(2)反應條件：94.0℃預變性5.0min，94.0℃變性1.0min，60.0℃退火1.0min，72.0℃延伸2.0min，共35循環，最后72.0℃延伸7.0min。(3)結果分析：取PCR產物10.0μl及DNA Marker 5.0μl于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1.2.4 統計學方法采用SPSS17.0進行統計分析；所有資料均為計數資料，組與組間的比較均用χ2檢驗，若四格表n＜40或T＜1則采用Fisher確切概率法。P＜0.05認為差異有統計學意義，P＜0.01認為有顯著統計學差異。

2 結果

71個標本均能成功地提取出總RNA(如圖1)，75.60%的肺癌組織以及65.85%的血液標本中均有hnRNPA2/B1的基因表達；而肺部良性病變患者組織以及血液中hnRNPA2/B1的基因表達明顯減少，表達率分別為26.67%、20%(圖2、3)，具體基因表達情況見表2～5。

2.1 血液hnRNP A2/B1的基因檢測血液中hn-RNP A2/B1基因表達在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組之間比較無統計學意義(χ2＝0.638，P＞0.05);在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與肺部良性病變組之間比較有顯著統計學意義(χ2＝7.284，P＜0.01);在Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組與肺部良性病變組之間比較有顯著的統計學意義(χ2＝14.091，P＜0.01)；吸煙患者與不吸煙患者之間進行比較均有顯著的統計學意義(χ2＝7.493，P＜0.01)，見表2和表3。

表2 3組血液hnRNP A2/B1的基因檢測結果比較

表3 吸煙因素血液hnRNP A2/B1的基因檢測結果比較

2.2 肺組織hnRNP A2/B1的基因檢測肺組織hnRNP A2/B1基因表達在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組之間比較無統計學意義(χ2＝0.397, P＞0.05);在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與肺良性病變組之間比較有統計學意義(χ2＝8.563，P＜0.01);Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組與肺良性病變組之間比較有顯著的統計學意義(χ2＝14.700，P＜0.01)。組織中吸煙患者與不吸煙患者之間進行比較有統計學意義(χ2＝5.386，P＜0.05)。

2.3 血液與組織hnRNP A2/B1基因檢測結果比較本研究發現病變肺組織和血液的敏感性及特異性比較無統計學意義。從表2和表4數據比較得出I期-Ⅱ期肺癌組血液與組織hnRNP A2/B1基因表達之間無統計學意義(χ2＝0.515,P＞0.05);同樣Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組血液與組織中檢測hnRNP A2/B1基因表達差別無統計學意義(χ2＝0.444,P＞0.05)。

表4 三組肺組織hnRNP A2/B1的基因檢測結果比較

表5 吸煙因素肺組織hnRNP A2/B1的基因檢測結果比較

圖1 總RNA電泳圖

圖2 血液標本的β-actin電泳圖

圖3 血液陽性標本電泳圖(在280bp處可見陽性條帶)

3 討論

HnRNP是一組核內RNA結合蛋白，由30多個蛋白質小分子構成復合體,其主要功能與RNA轉錄、外顯子剪接、剪接位點選擇以及Pre-mRNA的成熟和降解有關[3]。hnRNP A2/B1是hnRNP的主要組成部分，它可在核內連接前RNA，并在RNA處理和連接位點的選擇中起重要作用；此外，可在核與胞質間穿梭，具有將mRNA輸出到胞質的功能；hnRNP還參與RNA的代謝、轉錄和DNA的復制[4-6]。hnRNP A2/B1在胚胎期正常肺發育的關鍵階段過度表達，表達水平與肺癌及癌前病變類似，在正常發育的成熟肺組織中的表達被抑制；其在肺癌中的表達類似于胚胎肺發育關鍵期，這種表達在蛋白質和分子水平是一致的，表明hn-RNP A2/B1可能是一種癌生長蛋白。近年來有研究表明hnRNP A2/B1表達異常與肺癌關系尤為密切[7-9]。本研究檢測Ⅰ-Ⅱ期肺癌組、Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組及肺部良性病變三組樣本外周血以及肺組織中hnRNP A2/B1的基因表達。結果表明在Ⅰ-Ⅱ期早期肺癌組與肺部良性病變組之間比較有統計學意義(P＜0.05)；Ⅰ-Ⅱ期肺癌組其肺組織hnRNP A2/B1表達與血液比較無統計學意義(P＞0.05)。分析可能由于肺癌早期腫瘤生長過程中組織細胞壞死后hnRNP A2/B1核酸釋放入血，導致血漿的mRNA濃度升高；此外，肺組織血供非常豐富，肺癌早期血液中可能已出現了hnRNP A2/B1異常表達，這與一些文獻報道相符[10，11]。由此看來，外周血hn-RNP A2/B1作為一種腫瘤標志物對早期非小細胞肺癌進行輔助診斷具有一定臨床意義。

本研究將吸煙患者與非吸煙者比較，發現吸煙組外周血以及組織中hnRNP A2/B1的基因表達陽性率分別為67.65%和70.58%，明顯高于不吸煙患組的35.14%和42.34%，兩組率之間比較有統計學意義(P＜0.05)，這與Zhou的研究一致，推測吸煙可能為誘導機體hnRNP A2/B1基因表達上調的一個高危因素[12,13]。

在臨床工作中，肺腫塊切除術及肺腫塊活檢均為有創操作，且考慮到術后的腫瘤細胞可能種植擴散，要獲取肺組織標本非常困難。外周血標本容易獲取，而綜合性醫院臨床檢驗中心RNA提取和RT-PCR技術實施也比較普遍。因此檢測外周血hnRNP A2/B1的表達在非小細胞肺癌的早期診斷中有臨床可行性，與其它肺癌相關指標聯合應用將有助于肺癌臨床早期診斷，爭取早期救治，提高患者五年生存率。

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Diagnostic value of the peripheral blood hnRNP A2/B1 in NSCLC patients

LONG Yingying,GU Yan,LI Xi,et al.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To explore the value of detecting hnRNP A2/B1 in peripheral blood of non-small cell lung cancer，and to analyze the effects of smoking on the expression of hnRNP A2/B1 in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods A total of 71 patients were excised lung mass in our hospital from January 2009 to June 2012,who were divided into three groups:17 patients with lung cancer in stageⅠ-Ⅱ，24 patients with lung cancer in stageⅢ-Ⅳand 30 patients with pulmonary benign lesions. There were 34 patients in smoking group and 37 were in non-smoking group.HnRNP A2/B1 mRNA was extracted from peripheral blood and lung tissue.The hnRNP A2/B1 mRNA expression was analyzed with RT-PCR technology,and the three groups of patients were compared with hnRNP A2/B1 mRNA in peripheral blood and diseased lung tissue;and influence of smoking on peripheral blood and lung tissue hnRNP A2/B1 expression was analyzed.Results The expression of hnRNP A2/B1 was no significant difference between the peripheral blood and the cancer tissue in the patients of lung cancer(P＞0.05).The expression of hnRNP A2/ B1 in patients with NSCLC was markedly higher than that in patients with pulmonary benign lesions(P＜0.01).The hnRNP A2/B1 in the smoking group was higher than that in the non-smoking group(P＜0.05).Conclusion Detection of peripheral blood hnRNP A2/ B1 is a valuable way of diagnosis on NSCLC.Smoking is a high risk factor on the upregulation of expression of hnRNP A2/B1 in human.

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1；NSCLC；Smoking

R734.2

A

1674-1129(2013)03-0217-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.006

江西省自然科學基金項目編號(00183781511219043)江西省衛生廳課題項目編號(20121188)

龍穎穎,男，38歲,畢業于南昌大學醫學院，碩士，研究方

向肺癌的多耐藥性。