江西省檢測(cè)HIV-1新近感染的BED捕獲酶免疫實(shí)驗(yàn)的室內(nèi)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

靳廷麗，唐翼龍，易志強(qiáng)，劉麗萍，樊寒藝

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

江西省檢測(cè)HIV-1新近感染的BED捕獲酶免疫實(shí)驗(yàn)的室內(nèi)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

靳廷麗，唐翼龍，易志強(qiáng)，劉麗萍，樊寒藝

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西南昌330029)

目的對(duì)江西省BED捕獲酶免疫檢測(cè)方法(BED capture enzyme immunoassay,BED-CEIA，簡(jiǎn)稱(chēng)BED)的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法在江西省艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室使用BED方法對(duì)2011-2012年新確證的艾滋病病毒抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行新近感染檢測(cè)。對(duì)每次試驗(yàn)的試劑質(zhì)控品(陰性對(duì)照、校準(zhǔn)品、弱陽(yáng)性對(duì)照和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照)的吸光度OD值和標(biāo)化OD值(OD-n)的均值(Mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)進(jìn)行分析及對(duì)實(shí)驗(yàn)的初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性進(jìn)行比較。結(jié)果對(duì)OD-n的統(tǒng)計(jì)顯示，質(zhì)控品陰性對(duì)照的變異系數(shù)為37.3%。校準(zhǔn)品、弱陽(yáng)性對(duì)照和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照的變異系數(shù)在7%以內(nèi)；初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的回歸分析決定系數(shù)R2值達(dá)到了0.9以上。結(jié)論江西省艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室使用BED-CEIA方法較穩(wěn)定，質(zhì)控在控，結(jié)果可靠,但陰性對(duì)照變異系數(shù)有待于降低。

江西省；HIV-1；新近感染；BED；穩(wěn)定性；評(píng)價(jià)

長(zhǎng)期以來(lái)艾滋病病人(AIDS)、艾滋病病毒(HIV)感染者的病例報(bào)告、哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)、行為監(jiān)測(cè)等監(jiān)測(cè)方法,為發(fā)現(xiàn)艾滋病疫情,掌握艾滋病流行趨勢(shì)、高危行為的變化情況,以及評(píng)價(jià)干預(yù)措施的效果等提供了大量的依據(jù)。但通過(guò)上述監(jiān)測(cè)方法只能獲得累積感染率，無(wú)法獲得直接準(zhǔn)確的新近感染的數(shù)據(jù),不能敏感地反映疫情的真正變化趨勢(shì)和干預(yù)措施的效果,美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)組織開(kāi)發(fā)BED監(jiān)測(cè)方法，這種方法采用1型HIV病毒特異B、E和D亞型的gp41抗原決定序列所合成的分支肽作為抗原，檢測(cè)其抗體的一種捕獲酶免疫檢測(cè)方法，因此命名為BED-CEIA。其原理是人體感染艾滋病病毒后，體內(nèi)艾滋病病毒特異IgG抗體占人體總IgG抗體的比例隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升，通過(guò)檢測(cè)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)后HIV-IgG抗體占總IgG的比例達(dá)到一定的值來(lái)判斷是否為新近感染[1]。2011年我省艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室獲得該檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可。本研究是對(duì)該實(shí)驗(yàn)方法在我們實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)穩(wěn)定性做一評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象2011年至2012年全省艾滋病病毒抗體陽(yáng)性血清樣品。樣品的采集、運(yùn)輸、檢測(cè)及保存均嚴(yán)格按照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》要求執(zhí)行。檢測(cè)樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HIV-1抗體陽(yáng)性(蛋白免疫印跡試驗(yàn)(WB)為陽(yáng)性)；(2)血樣保存在-20℃以下，反復(fù)凍融少于3次，清亮、無(wú)嚴(yán)重溶血、無(wú)交叉污染；(3)如果同1人在3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)2份或以上的確認(rèn)陽(yáng)性血樣，將第1份樣本納入新近感染檢測(cè)，其余樣本從樣本中剔除。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)已向監(jiān)測(cè)系統(tǒng)報(bào)告的HIV感染者血樣(非初次診斷陽(yáng)性者)；(2)該血樣采集時(shí)間距HIV-1抗體陽(yáng)性檢測(cè)記錄時(shí)間已超過(guò)3個(gè)月；(3)接受抗病毒治療的HIV感染者血樣；(4)CD4細(xì)胞數(shù)＜200個(gè)／μl的艾滋病感染者血樣。

1.2 試劑和方法試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sedia公司，每個(gè)試劑盒均在效期內(nèi)。每盒試劑提供質(zhì)控品一套，包括陰性質(zhì)控(NC)、校準(zhǔn)品(CAL)、弱陽(yáng)性質(zhì)控(LPC)和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控(HPC)。新近感染檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)板中包含2個(gè)NC及各3個(gè)CAL、LPC和HPC。按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行處理。反應(yīng)結(jié)束后，OD值使用450nm檢測(cè)波長(zhǎng)、630nm參考波長(zhǎng)測(cè)定，OD值換算成OD標(biāo)化值(OD-n值)，質(zhì)控品：ODn值＝質(zhì)控品的中值OD值/校準(zhǔn)品的中值OD；樣品：初篩實(shí)驗(yàn)樣品ODn值＝樣品的OD/校準(zhǔn)品的中值OD；確認(rèn)實(shí)驗(yàn)各樣品的ODn值＝各樣品的中值OD值/校準(zhǔn)品的中值OD。初篩實(shí)驗(yàn)為單孔檢測(cè)，OD標(biāo)化值(OD-n值)＞1．2者為既往感染，OD-n值≤1．2者將進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)是將樣本分3孔重復(fù)檢測(cè)，OD-n值＞0．8者為既往感染，OD-n值≤0．8者為新近感染。實(shí)驗(yàn)中得到質(zhì)控品(NC、LPC和HPC)的OD以及其標(biāo)化的OD-n必須在試劑盒規(guī)定的范圍內(nèi)，該次實(shí)驗(yàn)才有效；否則為無(wú)效實(shí)驗(yàn)，需重復(fù)檢測(cè)。將樣品、質(zhì)控品的OD值輸入EXCEL表，計(jì)算酶標(biāo)板的質(zhì)控品(NC、CAL、LPC和HPC)OD和OD-n的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(Mean、SD和CV)，計(jì)算線性回歸分析決定系數(shù)R2，比較檢測(cè)樣品初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中OD-n值的一致性。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)中(包括初篩和確證實(shí)驗(yàn))的OD和OD-n的Mean、SD及變異系數(shù)(CV)值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)控品OD(OD-n)的Mean，SD和CV的比較

2.2 根據(jù)BED-CEIA方法的實(shí)驗(yàn)流程，初篩試驗(yàn)中OD-n＜1．2的樣品需要進(jìn)行BED確認(rèn)試驗(yàn)(3份重復(fù)檢測(cè))。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)中324樣品初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)OD-n的結(jié)果，其回歸分析決定系數(shù)R2為0．9143，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性可靠。

3 討論

樣品檢測(cè)的初篩試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)OD-n值一致性結(jié)果較好，其相關(guān)系數(shù)R2為0．9143，說(shuō)明BED實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性好，試劑盒本身穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較理想、可靠。變異系數(shù)(CV)是用于評(píng)價(jià)不同抗體滴度血清BED-CEIA測(cè)量值的離散程度(信度)。OD-n值是經(jīng)過(guò)標(biāo)化的OD值，OD值進(jìn)行標(biāo)化后測(cè)量值的集中度提高，標(biāo)化是必要的。本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)控品HPC和LPC的OD-n值的變異系數(shù)(6%～7%)小于OD值的變異系數(shù)(12.7%～16.8%)[2]。

本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性質(zhì)控品(LPC、HPC)的OD-n值的變異系數(shù)(6%～7%)與國(guó)家參比室的報(bào)道6%左右相近，而陰性質(zhì)控品(NC)的OD值變異系數(shù)達(dá)33.8%，明顯高于參比室的14.4%的值，也高于國(guó)外所報(bào)道的27．2%，這會(huì)使得使用低抗體滴度的標(biāo)本檢測(cè)的信度降低[3-6]。由于NC的測(cè)量值非常低，數(shù)值的稍許改變，會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增大，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的操作和實(shí)驗(yàn)室條件要求更加嚴(yán)格，需要進(jìn)一步提高檢測(cè)質(zhì)量控制。在我們實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)2次對(duì)照和校準(zhǔn)品OD值低于試劑盒要求范圍，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)效，考慮為孵育溫度偏低所影響，這也說(shuō)明在開(kāi)展BED-CEIA檢測(cè)之前，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室的硬件進(jìn)行嚴(yán)格的現(xiàn)場(chǎng)檢查[7]。

為保證BED檢測(cè)方法的質(zhì)量控制要做到：建立BED檢測(cè)的SOP文件和QA/QC計(jì)劃；酶標(biāo)儀和加樣器需在校準(zhǔn)有效期內(nèi)；每次試驗(yàn)必須通過(guò)質(zhì)控；任何一次檢測(cè)出現(xiàn)無(wú)效實(shí)驗(yàn)，均需進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，一旦實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏倚，要仔細(xì)檢查試劑和質(zhì)控品的有效期以及貯存溫度；核對(duì)洗液的配制濃度；檢查酶標(biāo)儀、洗板機(jī)及加樣器的校準(zhǔn)期；嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)控制孵育溫度和時(shí)間，所有上述事項(xiàng)核對(duì)無(wú)誤后，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可以看出該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均十分好，但還有不足之處，我們還需進(jìn)一步提高檢測(cè)的精確性，做好檢測(cè)前、檢測(cè)中和檢測(cè)后的質(zhì)量控制，相信BED-CEIA方法會(huì)在我省的艾滋病防治事業(yè)中會(huì)發(fā)揮重要作用。

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R512.91，R446.62

A

1674-1129(2013)03-0232-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.011

江西省衛(wèi)生廳重大招標(biāo)課題(編號(hào)：2010-2012)

靳廷麗，1978年出生，碩士，從事艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。