金針菇子實體多糖均一組分FVP60-C2制備及單糖組成分析

楊俊紅，張安強，孫培龍*

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州 310014)

金針菇子實體多糖均一組分FVP60-C2制備及單糖組成分析

楊俊紅，張安強，孫培龍*

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州 310014)

金針菇子實體經水提醇沉得水溶性粗多糖，再經DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱和凝膠柱層析純化，得到均一多糖FVP60-C2；采用高效液相色譜、紫外-可見光光譜全掃描和傅里葉變換紅外光譜研究其理化性質；樣品經三氟乙酸水解，乙酰衍生化后，用單糖標準品作對照，用氣相色譜分析其單糖組成。結果表明：FVP60-C2為均一多糖，平均分子質量為1.429 ×104D；其是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，各單糖的物質的量比為0.74:0.21:1.36:1.00:1.31。

金針菇；多糖；理化特征；氣相色譜；單糖組成

金針菇(Flammulina velutipes)又名樸菇、冬菇、構菌、青杠菌、毛柄金錢菌，隸屬擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，金錢菌屬[1]。金針菇含有豐富的VC、尼克酸等多種維生素及鈣、鐵等多種礦物質[2-3]，具有眾多的藥理作用，是較普遍的藥食兩用真菌，具有廣闊的開發前景。金針菇多糖是金針菇中主要的生物活性物質之一，具有抗腫瘤、免疫調節、護肝和抗氧化等作用[4-8]。目前有關金針菇多糖研究主要集中在粗多糖提取和生物活性[9-13]方面，對粗多糖的分離純化及結構分析研究還較少。本實驗從金針菇中經提取、純化獲得均一多糖FVP60-C2組分，應用紫外-可見光光譜全掃描(UV)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和高效液相色譜(HPLC)研究其理化性質，應用氣相色譜(GC)確定其單糖組成和物質的量比，旨在為金針菇的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥金針菇子實體購買于浙江江山縣，江山市農業局農科所鑒定。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S100和S400 High-Resolution填料 美國GE公司；葡聚糖標準品、單糖標準品(巖藻糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖)、硼氫化鈉 美國Sigma公司；三氟乙酸 德國Merck公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AKT? prime低壓層析儀 美國AKT?公司；RI2000示差檢測器 德國Schambeck SFD GmbH公司；Waters1525 高效液相色譜儀、Waters2414示差檢測器美國Waters公司；TSKgel G4000PWXL高效液相色譜柱 日本Tosoh公司；XK雙層層析柱(16mm×100cm、26mm×100cm) 美國GE公司；UV-2450PC紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；Agilent 7890A氣相色譜 美國Aglient公司。

1.3 金針菇多糖均一組分FVP60-C2的制備

1.3.1 粗多糖提取

稱取干燥金針菇子實體2kg，加20倍蒸餾水，于90℃水浴條件下提取3次，每次3h。合并3次浸提液，離心，減壓濃縮，濃縮液在攪拌下緩緩加入95%乙醇至乙醇體積分數達到40%，靜置過夜，離心，上清液中繼續加入乙醇至終體積分數為60%，離心，收集沉淀，蒸餾水溶解，冷凍干燥，得多糖粗品FVP60。

1.3.2 粗多糖的分離純化

將粗多糖FVP60溶于蒸餾水中，配成1mg/mL溶液，10000r/min離心10min，取上清液經DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱(XK 26mm×100cm)層析，每次上樣20mL，依次用蒸餾水洗脫500mL，0～2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫200mL，2mol/L NaCl溶液洗脫200mL，蒸餾水洗脫600mL，自動部分收集，每管10mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，根據糖顯色反應收集多糖組分。

離子柱洗脫下來的樣品配制成10mg/mL水溶液，0.45μm膜過濾，采用AKT? prime層析系統進一步純化。溶液先經Sephacryl S100 High-Resolution凝膠柱(XK 16mm×100cm)脫鹽。上樣量：5mL；流速：1mL/min；每管5mL自動部分收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集多糖組分。脫鹽后組分再用Sephacryl S400 High-Resolution凝膠柱(XK 16mm×100cm)按照上述洗脫條件進一步純化，得到FVP60-C2均一組分。

1.4 FVP60-C2的純度及分子質量[14]

采用Waters1525高效液相色譜系統。色譜柱：TSKgel G4000PWXL；流動相：脫氣雙重蒸水；流速：1mL/min；進樣量：10μL；柱溫：(30±1)℃；檢測器：Waters2414示差檢測器檢測。

取標準葡聚糖(分子質量分別為1、5、12、80、150、270、670kD)配成適當濃度的溶液，0.45μm膜過濾，進樣10μL，測定保留時間。以分子質量的對數為縱坐標(y)，保留時間為橫坐標(x，min)，繪制標準曲線：y=—0.5854x+9.7143(R2=0.9935)。

取樣品2mg溶于2mL蒸餾水，微孔濾膜過濾，取濾液10μL進樣，測得保留時間，根據標準曲線計算分子質量。

1.5 FVP60-C2的理化特征分析

1.5.1 紫外-可見光光譜全掃描檢測

稱取FVP60-C2樣品2mg，配成1mg/mL水溶液，采用紫外-可見分光光度計在200～800nm進行全波長掃描檢測。

1.5.2 傅里葉變換紅外光譜分析[15]

取2mg干燥FVP60-C2樣品，采用KBr壓片，在4000～400cm-1內進行紅外光譜掃描。

1.6 FVP60-C2的單糖組成分析

1.6.1 標準單糖樣品乙酰化[16-17]

精確稱取等物質的量(2mmol)的半乳糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖，分別溶于3mL蒸餾水中，加入20～30mg硼氫化鈉(NaBH4)，于室溫下還原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，加入3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復4～5次，真空干燥過夜。加入4mL醋酐，100℃反應1h，然后加入少量甲苯，減壓濃縮蒸干。將乙酰化后的產物用3mL氯仿溶解后轉移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分振蕩后，除去上層水層，如此重復4次，氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10mL待GC分析。

1.6.2 樣品乙酰化

取FVP60-C2樣品2mg，放入薄壁長試管中，加入2mol/L的三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃水解2h。將水解液在低于40℃減壓蒸干，然后加入3mL甲醇蒸干，重復上述操作4～5次，以完全除去TFA，然后按照1.6.1節的方法進行還原、乙酰化，用氯仿定容至5mL，待GC分析。

1.6.3 色譜條件

Agilent 7890A氣相色譜：氫火焰離子化檢測器(FID)，高純氮氣作為載氣；毛細管柱：Agilent 19091J-413(30m×320μm，0.25μm)。

色譜條件：初始柱溫為120℃，以15℃/min升溫至240℃，恒溫6min，進樣量2μL，進樣口溫度為250℃，分流比1:50，檢測器溫度為250℃，氫氣流速35mL/min，空氣流速350mL/min，尾吹氣流速30mL/min，柱內流速為1mL/min。

1.6.4 GC分析及定量分析

所有單糖標樣均按照1.6.1節方法處理后用GC測定，確定每個單糖的保留時間。混標以同樣的方法處理后GC測定，重復進樣6次，根據各組分峰面積值計算混標氣相色譜圖的相對標準偏差(RSD1)；做6組混標樣品后GC測定，并計算出其相對標準偏差(RSD2)。

根據樣品與標準品的保留時間確定單糖種類。計算各糖組分的峰面積，采用面積歸一化方法，計算單糖面積平均百分含量，并計算各單糖響應因子，再根據等物質的量比的標樣組分，計算樣品各單糖物質的量比。

2 結果與分析

2.1 FVP60-C2的提取純化

金針菇子實體經熱水浸提，乙醇沉淀后得FVP60。FVP60經DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析的結果見圖1，收集FVP60-C。FVP60-C經Sephacryl S100 High-Resolution凝膠柱(圖2)脫鹽，再經Sephacryl S400 High-Resolution凝膠柱(圖3)進一步純化后得均一組分FVP60-C2。

圖1 FVP60 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of FVP60 by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography

圖2 FVP60-C Sephacryl S100 層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of FVP60-C by Sephacryl S100 column chromatography

圖3 FVP60-C 脫鹽后Sephacryl S400 洗脫曲線Fig.3 Elution curve of FVP60-C without salt by Sephacryl S400 column chromatography

2.2 FVP60-C2的純度及平均分子質量

圖4 FVP60-C2 HPLC 曲線Fig.4 HPLC of FVP60-C2

FVP60-C2經HPLC檢測為單一對稱峰，如圖4所示，說明FVP60-C2為均一多糖，根據保留時間計算出其平均分子質量為1.429×104D。

2.3 FVP60-C2的理化特征分析結果

2.3.1 紫外-可見光譜全掃描檢測結果

FVP60-C2的紫外-可見光譜全掃描結果(圖5)顯示在206nm波長處有多糖吸收峰，在280、260、620nm波長處未觀察到蛋白質(280nm)、核酸(260nm)及色素(620nm)等雜質峰。

圖5 FVP60-C2 紫外-可見光全掃描光譜圖Fig.5 UV scanning curve of FVP60-C2

2.3.2 紅外光譜分析

圖6 FVP60-C2紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum of FVP60-C2

由圖6可知，3410cm-1寬而強的吸收峰為糖分子內及分子外—OH基團伸縮振動峰；2930cm-1處為—CH2基團反對稱伸縮振動峰；在1660cm-1左右的峰是多糖水合振動峰；1360cm-1附近為飽和C—H彎曲振動吸收峰；1077cm-1較強的吸收峰為C=O伸縮振動特征峰，包括吡喃糖環的C—O—C伸縮振動和吡喃環中與羥基連接的C—O伸縮振動；1100cm-1和1010cm-1之間的3個吸收峰為吡喃糖環羥基的彎曲振動吸收峰；1730cm-1及1259cm-1附近無特征吸收峰，說明不含糖醛酸；831cm-1處有一吸收峰，提示FVP60-C2可能主要以α-糖苷鍵連接[18-20]。

2.4 FVP60-C2的單糖組成分析

混合單糖標準品的GC圖及其分析結果分別見表1和圖7。RSD1和RSD2均小于5%，表明本研究所采用的乙酰化方法可以滿足實驗要求，具有可操作性。根據平行處理6種混標的平均面積百分含量，計算出各個單糖組分相對于儀器的響應因子。

表1 混合標準品氣相色譜結果及分析Table1 GC results and analysis of mixed standards

圖7 混合單糖標準品氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of mixed monosaccharide standards

FVP60-C2的GC結果見圖8。將圖8與圖7相對照，根據保留時間推斷出，FVP60-C2是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖。采用面積歸一化方法，根據平均百分含量和響應因子得出其物質的量比為0.74:0.21:1.36:1.00:1.31。

圖8 FVP60-C2氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of FVP60-C2

3 討 論

本研究對金針菇子實體多糖進行分離純化得到均一組分FVP60-C2，經高效液相檢測為較單一的組分，表明所采用的純化方法具有較好的效果。確定多糖中單糖的組成是研究多糖化學結構的重要前提。根據金針菇多糖FVP60-C2水解成單糖后經乙酰化后的GC分析結果及面積歸一化法確定了各單糖的含量，但不能確定其糖苷鍵連接方式及構型的結構特征，詳細結構仍需做進一步的研究。

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Preparation and Monosaccharide Composition Analysis of Homogeneous Polysaccharide FVP60-C2 from Fruit Bodies of Flammulina velutipes

YANG Jun-hong，ZHANG An-qiang，SUN Pei-long*
(School of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Hot water extraction and ethanol precipitation were used to extract polysaccharide from fruit bodies of Flammulina velutipes. Crude polysaccharide extract was purified to obtain FVP60-C2 by ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. The physicochemical properties of FVP60-C2 were investigated by HPLC, UV and IR. Following the hydrolysis and acetylation of FVP60-C2, the monosaccharide compositions of FVP60-C2 were analyzed by GC. The results showed that FVP60-C2 was a homogeneous polysaccharide with molecular weight of 1.429 × 104D, which was composed of fucose, xylose, mannose, glucose and galactose with a molar ratio of 0.74:0.21:1.36:1.00:1.31.

Flammulina velutipes；polysaccharide；physico-chemical property；gas chromatography；monosaccharide composition

TQ929.2

A

1002-6630(2013)03-0086-04

2011-12-12

浙江省食用菌創新團隊項目(2009R50029)

楊俊紅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質的分離提取。E-mail：luoyuheluoxue@126.com

*通信作者：孫培龍(1964—)，男，教授，博士，研究方向為生物活性物質的分離提取。E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn