麝香草酚對食品常見污染菌的抑菌作用

王 娣，許 暉，錢時權，曹珂珂，任茂生，田長城

(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

麝香草酚對食品常見污染菌的抑菌作用

王 娣，許 暉，錢時權，曹珂珂，任茂生，田長城

(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

為闡明麝香草酚的抑菌作用，采用濾紙片法、牛津杯法和擴散法(打孔法)等體外抑菌實驗對食品中常見的10種污染菌進行抑菌作用研究，并測定麝香草酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳酸鏈球菌、異常漢遜氏酵母、釀酒酵母、黑曲霉、黃曲霉的最低抑菌質量濃度。結果表明：麝香草酚抑菌譜廣，對食品中常見污染菌有一定抑制作用，其中對細菌的抑菌效果最好。麝香草酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌質量濃度分別為10、20、20μg/mL。

麝香草酚；抑菌作用；濾紙片法；牛津杯法；擴散法

麝香草酚(thymol)，別名麝香草腦、百里酚，片狀結晶，極易溶于乙醇、乙醚、醋酸、氯仿和苯中。天然存在于唇形科植物百里香屬植物中，有百里香屬植物的辛香和草香香氣，是植物揮發油的主要成分(含50%左右)[1-2]，可用酚鈉鹽法從植物揮發油中單離出來，再經干燥、減壓蒸餾即得產品。百里香屬植物是一種頗具開發價值的多用途植物，可以作為天然調味品、藥用植物和蜜源植物等[3-5]。我國主要分布于甘肅、內蒙古等地區[6]。國內外學者對麝香草酚活性進行了不少研究。Chu等[7]用質量濃度30mg/L蒸汽麝香草酚對甜櫻桃進行熏蒸處理，可以有效抑制灰霉病和褐腐病，貯藏期間處理的甜櫻桃只有0.5%的灰霉病。Liu Weitang等[8]研究表明用2～4mg/L質量濃度的麝香草酚對杏和李熏蒸處理可顯著降低爛果率，而且對水果組織不產生任何影響。這說明麝香草酚具有一定抑菌防腐活性。本實驗采用濾紙片法、牛津杯法以及擴散法研究麝香草酚對食品中常見污染菌的抑制作用，為麝香草酚作為食品防腐劑的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌株

1.1.1 麝香草酚

麝香草酚(C10H14O，含量＞98%，分析純) 天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 供試菌種

細菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GIM 1.55、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GIM 1.131、大腸桿菌(Escherichia coli)GIM 1.154、變形桿菌(Proteus vulgaris)GIM 1.192、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)GIM 1.189、嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophilus)GIM 1.83；酵母：異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)GIM 2.18、釀酒酵母(Saccharmucescerevisiae)GIM 2.34、霉菌：黑曲霉(Aspergillus niger)GIM 3.24；黃曲霉(Aspergillus fl avus)GIM 3.18；以上菌種購于廣州微生物研究所。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基(BPA)：培養金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)采用牛肉膏蛋白胨培養基(BPA)；變形桿菌(Proteus vulgaris)用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(BPAE)，添加95%的酒精5mL/100mL。

乳酸細菌培養基(MRS瓊脂培養基)：培養保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophilus)采用MRS瓊脂培養基。

馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：培養異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala)、釀酒酵母(Sacchromuces cerevislac)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus fl avus)采用馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

1.1.4 儀器與設備

LRH-150-Ⅱ智能生化培養箱、SW-CJ-2F超凈工作臺 上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-40BI高壓滅菌鍋 北京京儀東方科技有限公司；LX41多功能顯微鏡上海富眾生物科學有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的準備

將供試菌種劃線接入相應的試管斜面培養基上，細菌于37℃恒溫培養箱中培養24h，酵母于28℃恒溫培養箱中培養48h，霉菌于28℃恒溫培養箱中培養5d，4℃冰箱中冷藏備用。

供試菌株菌懸浮液的制備：分別用接種環挑取少許細菌、酵母菌和霉菌孢子于裝有玻璃珠和10mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩，采用活菌計數法測定菌數[9]，制成菌體或孢子濃度為106～107CFU/mL的均勻菌懸浮液或孢子懸液。

1.2.2 濾紙片法測定抑菌效果

不同質量濃度的麝香草酚配制：麝香草酚加少許吐溫-80增溶[10]，再加適量無菌水超聲乳化、定容，配制成500、800、1000μg/mL不同質量濃度(吐溫-80含量不超過0.5%)。以0.5%的吐溫-80作為對照。

根據王忠民等[11]方法并加以改進。取滅菌后的濾紙圓片(d=6mm)，分別置于不同質量濃度的麝香草酚中浸泡10min，瀝去多余液體，置于已用0.1mL菌懸液涂布均勻的培養皿中，每個菌種做3次平行。細菌恒溫培養24h，酵母培養48h，霉菌培養5d，觀察有無抑菌作用。

1.2.3 牛津杯法測定抑菌效果

根據武忠偉等[12]實驗方法并加以改進。取滅菌烘干的牛津杯(外徑8mm、內徑6mm、高10mm)置于已用0.1mL菌懸液涂布均勻的培養皿中，用無菌微量移液器分別注入200μL不同質量濃度的麝香草酚(500、800、1000μg/mL)，每種菌做3個平行。培養溫度和時間同1.2.2節，觀察有無抑菌作用。

1.2.4 擴散法(打孔法)測定抑菌效果

根據李建慧等[13]方法并加以改進。用滅過菌的打孔器(孔徑6mm)在用0.1mL菌懸液涂布均勻的培養皿中十字對稱打4個孔，用無菌微量移液器分別加入100μL不同質量濃度的麝香草酚(500、800、1000μg/mL)，每種菌做3個平行。培養溫度和時間同1.2.2節，觀察有無抑菌作用。

重復驗證檢驗：在定性檢驗的基礎上，選取對麝香草酚敏感的3種細菌(金黃色葡萄球菌S. aureus、枯草芽孢桿菌B. subtilis、大腸桿菌E. coli)做重復驗證檢驗，觀測其抑菌圈直徑大小，以0.1%的苯甲酸鈉作為陽性對照。

1.2.5 最低抑菌質量濃度(MIC)的測定[13]

用滅過菌的打孔器(孔徑6mm)在培養皿(0.1mL菌懸液涂布均勻)中十字對稱打4個孔，分別加入2.5～320μg/mL系列質量濃度的麝香草酚100μL，以0.5%的吐溫-80作為對照，培養、觀察，得到最低抑菌質量濃度(MIC)。

2 結果與分析

2.1 濾紙片法測定抑菌結果由表1、圖1可知，麝香草酚對這10種食品中常見污染菌都有一定抑制作用。隨著麝香草酚質量濃度的增加，抑菌作用在不斷增強。麝香草酚質量濃度為1000μg/mL時，對細菌中的大腸桿菌抑菌作用最明顯，其次是金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；對酵母菌中的釀酒酵母抑菌作用要大于異常漢遜氏酵母；對霉菌中的黑曲霉抑菌作用稍強一些。

表1 濾紙片法測定不同質量濃度麝香草酚的抑菌效果Table1 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by filter paper disk

圖1 濾紙片法測定不同質量濃度麝香草酚的抑菌圈直徑Fig.1 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by filter paper disk

2.2 牛津杯法抑菌測定結果

表2 牛津杯法測定不同質量濃度麝香草酚的抑菌效果Table2 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by Oxford-cup test

圖2 牛津杯法測定不同質量濃度麝香草酚的抑菌圈直徑Fig.2 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by Oxford-cup test

由表2、圖2可知，隨著麝香草酚質量濃度的增加，抑菌作用不斷增強。麝香草酚質量濃度為1000μg/mL時，測定的抑菌圈直徑大小次序為：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞保加利亞乳桿菌＞變形桿菌＞釀酒酵母＞異常漢遜氏酵母＞嗜熱乳酸鏈球菌＞黑曲霉＞黃曲霉。與濾紙片法相比抑菌結果之所以有差別，可能是每次加入的菌懸液濃度有誤差，或者實驗操作有誤差所致。

2.3 擴散法(打孔法)測定抑菌結果

由表3、4及圖3可知，麝香草酚對細菌、酵母和霉菌均有較強的抑制作用，是一種廣譜性抑菌劑。其中對細菌的抑制作用要強于酵母菌和霉菌，尤其對細菌中的金黃色葡萄球菌抑菌作用最強。麝香草酚質量濃度為1000μg/mL的抑菌能力比0.1%苯甲酸鈉效果稍強一些。酚類物質具有抑菌性機理可能是[14]：菌體蛋白質與酚類物質通過氫鍵或疏水作用相結合從而喪失了活性；抑制了微生物細胞中的特定酶，使代謝過程發生異常；可能與微生物細胞生長所必需物質結合，導致微生物死亡等。

表3 擴散法測定不同質量濃度麝香草酚的抑菌效果Table3 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by diffusion test

圖3 擴散法測定不同質量濃度麝香草酚的抑菌圈直徑Fig3 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by diffusion test

表4 麝香草酚、苯甲酸鈉對細菌的抑菌效果Table4 Antimicrobial effects of thymol and sodium benzoate

2.4 最低抑菌質量濃度(MIC)的測定結果

由表5可知，MIC測定結果得到了10種菌的最低抑菌質量濃度，對細菌的抑制作用最強，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌質量濃度分別為10、20、20μg/mL。麝香草酚對食品污染菌的抑菌作用大小比較：對細菌抑制作用＞對酵母抑制作用＞對霉菌抑制作用。對霉菌抑菌效果差可能是由于霉菌大多是通過孢子繁殖，麝香草酚則是通過瓊脂培養基慢慢擴散與細胞接觸，因而對孢子抑制作用稍差而致[15]。麝香草酚是從可食用植物中提取出來的，安全性高，可考慮作為一種良好的天然食品防腐劑開發使用。

表5 麝香草酚對供試菌的最低抑菌質量濃度Table5 MIC of thymol against different bacteria

3 結 論

具有抗菌作用的植物的使用要遠比抗生素的歷史久遠的多，從植物中尋找毒副作用小、安全性高的天然植物防腐劑，一直是研究的熱點[16-20]。麝香草酚的資源豐富，成本低，對細菌、霉菌、酵母都有較強的抑制作用。實驗研究表明，麝香草酚對食品中常見的10種污染菌均有一定抑菌效果，其中，對細菌的抑制作用最強，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的最低抑菌質量濃度分別為10、20、20μg/mL。總體來看，麝香草酚對食品污染菌的最低抑菌質量濃度都很小，在10～160μg/mL之間，而作為食品添加劑的用量一般在10g/L以下，麝香草酚抑菌劑量遠低于這個標準。因此是一種潛在的、很有前途的食品防腐劑。盡管麝香草酚的抑菌作用很好，但是其帶有一種強烈的芳香味可能對食品的風味會產生一些不好的影響，因此限制了其使用的范圍，如何在保持其最大抑菌活性的基礎上，降低或消弱其強烈的芳香味，還有待進一步研究。

[1] SOLOMAKOS N, GOVARIS A. The antimicrnbial effect of thyme essential oil, nisin, and their combination against Listeria monocytogenes in minced beef during refrigerated storage[J]. Food Microbiology, 2008, 25: 120-127.

[2] BENSMIRA M, JIANG Bo, NSABIMANA C, et al. Effect of lavender and thyme incorporation in sunflower seed oil on its resistance to frying temperatures[J]. Food Research International, 2007, 40(3): 341-346.

[3] RASOOLI R, ABYANEH M R. Inhibitory efects of thyme oils on growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus[J]. Food Control, 2004, 15: 479-483.

[4] TABAK M, ARMON R. in vitro inhibition of helicobacter pylori by thyme extract[J]. Journal of Applied Bacterilogy, 1996, 80: 667-672.

[5] GOODNER K L, MAHATTANATAWEE K, PLOTTO A, et al. Aromatic profiles of Thymus hyemalis and Spanish Thymus uvlgaris essential oils by GC-MS[J]. Industrial Crops and Products, 2006, 24: 264-265.

[6] 員銘, 呂國華. 百里香應用價值研究[J]. 安徽農學通報, 2007, 13(2): 89-91.

[7] CHU C L, LIU Weitang, ZHOU Ting. Fumigation of sweet cherries with thymol and acetic acid to reduce post harvest brown rot and blue mold rot[J]. Fruits, 2001, 56: 123-130.

[8] LIU Weitang, CHU C L, ZHOU Ting. Thymol and acetic acid vapors reduce post harvest brown rot of apricot and plums[J]. Hort Science, 2001, 37: 151-156.

[9] 管至遠, 王艾琳, 李堅. 醫學微生物學實驗技術[M]. 北京: 化學工業出版社, 2005: 84.

[10] 劉曉麗, 鐘少樞, 吳克剛, 等. 丁香和肉桂精油氣相抑菌活性研究[J].食品與發酵工業, 2010, 36(1): 21-24.

[11] 王忠民, 程明冬, 王有平. 葡萄多糖的抑菌作用研究[J]. 食品科學, 2007, 28(7): 35-38.

[12] 武忠偉, 王運兵, 趙現方, 等. 冬蟲夏草和蛹蟲草發酵液抗菌活性研究[J]. 微生物學雜志, 2008, 28(4): 47-50.

[13] 李建慧, 馬會琴, 陳尚武. 葡萄多酚抑菌效果的研究[J]. 中國食物學報, 2008, 8(2): 100-106.

[14] 樊明濤, 李亞琴. 百里香提取物抑菌作用影響因素研究[J]. 江蘇理工大學學報: 自然科學版, 2001, 22(3): 13-16.

[15] 呂世明, 陳仗榴, 陳建新, 等. 丁香酚體外抑菌作用研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 122-124.

[16] 鐘瑞敏, 王羽梅, 曾慶孝, 等. 芳香精油在食品保藏中的應用進展[J].食品與發酵工業, 2005, 31(3): 93-94.

[17] 劉勝貴, 彭斯文, 閔丹. 18種抗炎癥中草藥的抑菌作用研究[J]. 現代中醫藥, 2007, 27(2): 41-43.

[18] 趙子劍, 赫媛媛, 張英. 七種清熱解毒類中藥對四種標準菌株的作用[J]. 陜西中醫醫學院學報, 2007, 30(1): 58-60.

[19] 呂平, 黃惠芳, 韋麗君. 四種植物提取物的抑菌作用研究[J]. 食品科技, 2010, 35(12): 216-219.

[20] 陸志科, 謝碧霞. 植物源天然食品防腐劑的研究進展[J]. 食品工業科技, 2003, 24(1): 94-96.

Antimicrobial Activity of Thymol against Foodborne Pathogenic Bacteria

WANG Di，XU Hui，QIAN Shi-quan，CAO Ke-ke，REN Mao-sheng，TIAN Chang-cheng
(Department of Biology and Food-Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The antimicrobial activity of thymol against foodborne pathogenic bacteria was studied by filter paper disks, Oxferd-cup test and diffusion test. The minimum inhibitory concentrations of thymol against10 kinds of foodborne pathogenic bacteria such as Proteus vulgaris, Lactobacillus bulgaricus, Streptococus thermophilus, Hansenula Anomala, Saccharmuces cerevisiae, Aspergillus niger and Aspergillus flavus were determined. The results showed that thymol had obvious antimicrobial activity against these foodborne pathogenic bacteria in wide-spectrum manner. The minimum inhibitory concentrations of thymol against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Escherichia coli were 10, 20 μg/mL and 20 μg/mL, respectively.

thymol；antimicrobial activity；filter paper disk；Oxferd-cup test；diffusion test

TS202.3

A

1002-6630(2013)03-0119-04

2011-12-04

安徽省高校優秀青年人才基金項目(2010SQRL116)

王娣(1976—)，女，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：Wangdibbxy@yahoo.cn