微生物發酵羅非魚骨粉工藝條件的優化

馬海霞，楊賢慶,*，李來好，陳勝軍，吳燕燕，楊 燕

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東 廣州 510300；2.國家水產品加工技術研發中心，廣東 廣州 510300)

微生物發酵羅非魚骨粉工藝條件的優化

馬海霞1,2，楊賢慶1,2,*，李來好1，陳勝軍1，吳燕燕1，楊 燕1

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東 廣州 510300；2.國家水產品加工技術研發中心，廣東 廣州 510300)

采用乳酸菌對羅非魚骨粉進行發酵，并對最適發酵條件進行研究。單因素試驗結果表明，羅非魚骨粉的最適發酵菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，裝液量為30%，料液比為1:5(m/V)，最適糖類為葡萄糖，起始pH值自然；混合水平正交試驗結果表明，各因素對游離Ca2+含量影響的主次順序為：發酵時間＞葡萄糖用量＞接種量＞發酵溫度＞骨粉粒徑，其中發酵時間對游離Ca2+含量有顯著影響(P＜0.05)，最優發酵條件為發酵時間8d、接種量8%、葡萄糖用量5%、溫度37℃、骨粉粒徑＜0.075mm。

微生物；發酵；羅非魚；魚骨粉

鈣具有重要的生理功能，對維持生命活動非常重要[1]。隨著人們生活水平的提高和健康保健意識的增強，各類人群在日常生活中越來越注重補鈣。動物骨頭中除含有大量鈣質外，還含有蛋白質、脂肪、骨膠原、軟骨素、鐵、鋅、鎂、磷等營養元素，是開發骨源補鈣產品的良好資源。動物骨頭中的鈣主要是以羥磷灰石晶體[Ca10(PO4)6(OH)2]和無定型磷酸氫鈣(CaHPO4)的形式存在，羥磷灰石晶體和無定型磷酸氫鈣被大量的膠原纖維緊密包裹，形成致密的組織不易被人體吸收利用，人體要以動物骨頭為鈣源，就必須將這種致密的組織破壞。近年來，有國內學者采用微生物對畜禽骨頭進行發酵制備營養液[2-7]，使其中結合態的鈣轉化為游離鈣，這有利于人體對鈣的吸收和鈣在人體內的沉積，該法兼有酸解、酶解和生物轉化的共同作用，但是利用微生物發酵魚骨開發補鈣產品還鮮少見諸報道。本研究以羅非魚魚頭、魚排為鈣源，通過篩選出合適的發酵菌株，優化發酵工藝條件，開發出一種補鈣營養制劑，為魚類加工下腳料魚骨的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌種

魚頭、魚排由廣州市恒發水產有限公司提供。

鈣標準溶液(質量濃度為(999±2)mg/L) 德國Merck公司；其他試劑均為分析純，所有用水均為超純水。

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，GIM1.190，簡寫成Lc)，嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophiles，GIM1.83，簡寫成St)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，GIM1.191，簡寫成Lp) 廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 儀器與設備

MARS5微波消解器 美國CEM公司；AA240FS原子吸收分光光度計 美國Varian公司；超純水儀 美國Millipore公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；明鑒SPX型智能生化培養箱 寧波江南儀器廠；PB-10 pH計 德國Sartorius集團；VULCAN 3-550馬弗爐 美國Neytech公司。

1.3 方法

1.3.1 魚骨粉制備

將魚頭、魚排斬碎，沸水煮約2h，然后撈出用自然水清洗干凈，于80℃烘約3.5h，粉碎、過篩后密封于干燥處保藏備用。

1.3.2 發酵菌株篩選

將羅非魚骨粉(粒徑：0.075～0.150mm)、水、葡萄糖分別按質量分數22.5%、67.5%、5%的比例配制成魚骨粉發酵液，魚骨粉和水的質量占總發酵液質量的90%(下同)，121℃滅菌15min，冷卻，無菌條件下分別接入5%的已活化2代的Lp、Lc、St種子液，于37℃培養。在發酵第0、1、2、3、4、5、6、7、8天取樣測定魚骨粉發酵上清液的pH值和總酸度。每個處理做3個平行，取平均值。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 發酵液起始pH值

將魚骨粉發酵液用稀鹽酸和NaOH溶液調節起始pH值分別至5.5、5.9、6.3、6.7、7.1、7.5，121℃滅菌15min，冷卻，無菌條件下分別接入5%的Lc種子液發酵8d，測定魚骨粉發酵上清液中游離Ca2+含量。每個處理做3個平行，取平均值。

1.3.3.2 裝液量

在250mL的三角瓶中分別移入25、50、75、100、125mL(對應的裝液量分別為10%、20%、30%、40%、50%)魚骨粉發酵液，pH值自然，121℃滅菌15min，冷卻，無菌條件下分別接入5%的Lc種子液發酵8d，測定魚骨粉發酵上清液中游離Ca2+含量。每個處理做3個平行，取平均值。

1.3.3.3 料液比

按料液比(魚骨粉:水)分別為1:2、1:3、1:5、1:7、1:10配制不同魚骨粉發酵液，葡萄糖5%，裝液量均為30%，pH值自然，121℃滅菌15min，冷卻，無菌條件下分別接入5%的Lc種子液發酵8d，測定魚骨粉發酵上清液中游離Ca2+含量。每個處理做3個平行，取平均值。

1.3.3.4 糖用量

分別添加5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖+乳糖(質量比1:1)，配制成不同魚骨粉發酵液，料液比1:5，裝液量30%，pH值自然，121℃滅菌15min，冷卻，無菌條件下分別接入5%的Lc種子液發酵8d，測定魚骨粉發酵上清液中游離Ca2+含量。每個處理做3個平行，取平均值。

1.3.4 混和水平正交試驗設計

參考相關文獻[2-3,5,7]發現發酵時間、接種量、葡萄糖用量、發酵溫度和骨粉粒徑是影響乳酸菌發酵動物骨粉的重要因素，由前面單因素試驗確定發酵菌株、起始pH值、裝液量、料液比和最適糖用量后，選擇發酵時間(A)、接種量(B)、葡萄糖用量(C)、發酵溫度(D)、骨粉粒徑(E)5個因素，以魚骨粉發酵上清液中游離Ca2+含量為評定指標，采用L18(6×36)對發酵工藝條件進行優化。

1.3.5 測定指標

1.3.5.1 pH值和總酸度測定

pH值：取魚骨粉發酵液離心(3000r/min，5min)，取發酵上清液，用pH計測其pH值。

總酸度(以乳酸計)：取魚骨粉發酵上清液約10.00g，以酚酞為指示劑，用0.1000mol/L的NaOH標準溶液滴定至終點，記下所耗NaOH的體積，用下式[8]計算。

式中：V為滴定時NaOH標準溶液的用量/mL；c為NaOH標準溶液的濃度/(mol/L)；k為乳酸的換算系數0.09；m為樣品質量/g。

1.3.5.2 游離Ca2+含量測定

采用微波消解-火焰原子吸收分光光度法測定。樣品前處理：準確吸取發酵上清液1mL，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10mL，在微波消解儀中消解(功率800W，比例100%，升溫時間15min，消解溫度180℃，保持時間20min)。消解結束后，取出消解罐，冷卻，將消解液轉移至聚四氟乙烯溶樣杯中，在電熱板上于180℃趕酸直至消解液為無色透明，冷卻，然后將其轉入100mL容量瓶中用0.1% LaCl3定容，待測定。

儀器測定操作參數：波長422.7nm，夾縫0.5nm，空氣流量13.5L/min，乙炔流量2.00L/min，燈電流10.0mA。

1.3.5.3 一般營養成分測定

蛋白質：采用微量凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》執行[9]；脂肪：采用索氏抽提法，參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》執行[10]；鈣、鐵、鋅、鎂：采用火焰原子吸收法，參照GB 5413.21—2010《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中鈣、鐵、鋅、鈉、鉀、鎂、銅和錳的測定》執行[11]；磷：參照GB/T 5009.87—2003《食品中磷的測定》執行[12]。

2 結果與分析

2.1 羅非魚骨粉的基本成分

表1 羅非魚魚骨粉的基本成分Table1 Basic nutrition components in tilapia fishbone meal

如表1所示，羅非魚魚骨中鈣含量高達26.05%，蛋白質、鈣、磷三者含量達到62.09%，其中鈣磷比約為1.9:1，是適合于人體對鈣吸收的比例[13]。

2.2 發酵菌株的篩選

圖1 3株乳酸菌的pH值和總酸度的變化Fig.1 Changes of pH and total acidity during the fermentation by three lactic acid bacteria

由圖1可知，與第0天相比，發酵第1天3種發酵上清液中的pH值下降幅度都明顯較大，隨后接種St的發酵液的pH值一直在5.20左右波動；而分別接種Lp和Lc的發酵上清液的pH值則繼續下降，但下降幅度趨緩，發酵至第5天以后，接種Lp和Lc的發酵上清液的pH值分別在4.45和4.16左右波動。pH值的這種變化趨勢與Tang等[14]的研究結果相似，他們采用7株乳酸菌分別發酵強化鈣的豆奶，與第0天相比也發現接種的7種豆奶的pH值在發酵第1天顯著下降(P＜0.05)，隨后下降幅度明顯減緩。在發酵至第2天以后在同一發酵時間內，接種Lc的發酵上清液pH值最低，接種Lp的次之，接種St的最高。

隨著發酵時間的延長，3種發酵上清液的總酸度均有不同程度的上升。與pH值的變化趨勢相對應，在整個發酵期間，接種Lc的發酵上清液的總酸度一直明顯高于接種其他兩種乳酸菌的，接種St的發酵上清液中的總酸度最低。從發酵第5天起，3種發酵上清液的總酸度曲線均趨于平緩，表明這3種發酵液的總酸度增速減緩。乳酸菌利用魚骨粉中的蛋白質等營養物質和添加的葡萄糖進行生長代謝不斷產生乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸等有機酸，使發酵液中的總酸度升高，pH值降低。而在酸性環境中，魚骨粉中鈣離子溶解度會增大，更有利于吸收[15]。3株乳酸菌中，Lc的產酸性能最強，所以選取Lc作為發酵菌株。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 發酵液起始pH值的影響

由圖2可知，對照(未調節pH值)中游離Ca2+含量最高，達到3.96mg/mL，調節起始pH值在5.5～7.5之間時，發酵上清液中游離Ca2+含量在3.16～3.55mg/mL之間。不同批次羅非魚骨粉發酵液的初始pH值并不相同，而是在pH5.6～7.0范圍之內變動，這可能與羅非魚的養殖方式、捕獲季節、大小規格等因素有關。由于調節魚骨粉發酵液的起始pH值后，其發酵上清液中游離Ca2+含量反而比對照的小，因此在后面的實驗中無需調節魚骨粉發酵液pH值，即起始pH值自然。

2.3.2 裝液量的影響

圖3 裝液量對游離Ca2+含量的影響Fig.3 Effect of fermentation liquid volume on free Ca2+content

由圖3可知，裝液量為40%和50%時，發酵上清液中的游離Ca2+含量明顯小于其他3組裝液量；裝液量分別為10%、20%、30%時，其發酵上清液中的游離Ca2+含量則分別為3.97、4.06mg/mL和4.04mg/mL，基本無差異。Lc是兼性好氧菌，裝液量大很可能影響了魚骨粉發酵液中的溶氧量，從而影響Lc的生長代謝和產酸能力，進而影響魚骨粉中結合態鈣的溶出。但裝液量大可提高設備的利用率，提高發酵上清液產量。綜合考慮，最適裝液量為30%。

2.3.3 料液比的影響

由圖4可知，料液比為1:2時其發酵上清液中游離Ca2+含量最高，達到3.42mg/mL，料液比分別為1:3、1:5時其發酵上清液中的游離Ca2+含量分別為3.11、3.10mg/mL，基本無差異；而料液比分別為1:7、1:10時其發酵上清液中的游離Ca2+含量要略少，分別為2.84、2.85mg/mL，也基本無差異。發酵液總質量相同，料液比越大(即魚骨粉用量越大)，發酵后離心所獲得的上清液就越少，雖然其游離Ca2+含量質量濃度較高，但游離Ca2+總量卻不一定與其質量濃度一致。綜合考慮魚骨粉用量和游離Ca2+總含量，最適料液比為1:5。

圖4 料液比對游離Ca2+含量的影響Fig.4Effect of meal-water ratio on free Ca2+content

2.3.4 糖種類的影響

圖5 糖種類對游離Ca2+含量的影響Fig.5 Effect of sugar addition on free Ca2+content

由圖5可知，與對照相比，添加糖類可明顯提高發酵上清液中游離Ca2+含量，但添加的糖種類不同，其游離Ca2+含量也會有差異。發酵結束后，添加不同糖類的發酵上清液中游離Ca2+含量的大小順序為：葡萄糖＞葡萄糖+乳糖＞乳糖＞蔗糖。葡萄糖為魚骨粉乳酸菌發酵的最適碳源。

2.4 混合水平正交試驗結果分析

混合水平正交試驗(L18(6×36))極差分析結果和方差分析結果分別見表2、3。由表2可以直觀看出，對發酵上清液中游離Ca2+含量影響的因素順序是A＞C＞B＞D＞E，5個因素的最優組合為A6B3C2D2E3，即發酵時間8d、接種量8%、葡萄糖用量5%、溫度37℃、骨粉粒徑＜0.075mm；由表3可知，因素A對游離Ca2+含量有影響顯著(P＜0.05)。經驗證實驗在此最優組合條件下，發酵上清液中游離Ca2+含量為5.86mg/mL。

表2 正交試驗方案及結果Table2 Design and results of orthogonal tests

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Analysis of variance for orthogonal tests

3 結 論

在羅非魚骨粉發酵液中，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的產酸性能要優于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophiles)，是最適發酵菌株；裝液量、料液比對魚骨粉發酵上清液中的游離Ca2+含量有一定影響，獲得最適裝液量30%、料液比1:5；與對照相比，是否添加糖及糖的種類對游離鈣Ca2+含量影響較大，不同糖類對游離Ca2+含量的影響大小順序為：葡萄糖＞葡萄糖+乳糖＞乳糖＞蔗糖，葡萄糖為魚骨粉乳酸菌發酵的最適碳源。

干酪乳桿菌發酵羅非魚骨粉，可明顯提高魚骨粉發酵液中的游離Ca2+含量。采用混合水平正交試驗(L18(6×36))優化發酵工藝條件后，在發酵時間8d、接種量8%、葡萄糖用量5%、發酵溫度37℃、骨粉粒徑＜0.075mm條件下，發酵上清液中游離Ca2+含量為5.86mg/mL，遠高于牛奶中的Ca2+含量(1.20mg/mL)。

乳酸菌在發酵過程中產生乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、富馬酸等有機酸[16]和游離氨基酸、多糖、酶等代謝物，使魚骨中的鈣由結合態轉化為游離態，這是酸解、酶解和生物轉化等的協同作用效果。據報道，動物骨頭經乳酸菌發酵后還會產生一些功能性物質[17]。魚骨中除鈣外，還含有大量的Fe、Zn、Mg、P等礦物質，因此，乳酸菌在發酵羅非魚骨粉過程中的代謝產物，如有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸和多糖等的種類及其含量的變化規律，以及代謝產物對魚骨中Ca、Fe、Zn、Mg、P等含量的影響，魚骨發酵補鈣營養制劑的功能評價等都是下一步研究分析的問題。

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Optimization of Fermentation Process for Tilapia Bone Meal

MA Hai-xia1,2，YANG Xian-qing1,2,*，LI Lai-hao1，CHEN Sheng-jun1，WU Yan-yan1，YANG Yan1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2. National R&D Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China)

Current studies have revealed that the content of free calcium in fermented fishbone meal with lactic acid bacterial (LAB) was significantly increased. In order to improve fermentation technology, the optimal fermentation conditions for tilapia bone meal were explored. The single factor experimental results indicated that the optimal LAB species was Lactobacillus casei, and the optimal fermentation liquid volume was 30%, optimal meal-liquid ratio was 1:5 (m/V) and optimal saccharide was glucose at natural pH. The orthogonal test showed that the factors for influencing free calcium content were: fermentation period＞glucose dosage＞inoculation amount＞fermentation temperature＞meal granule size, in which the fermentation period revealed the most obvious impact on free calcium content (P＜0.05). The optimal fermentation conditions were fermentation duration of8 days, inoculation amount of 8%, glucose amount of 5%, fermentation temperature of 37 ℃, and bone meal granule size less than 0.075 mm.

microorganism；fermentation；tilapia；fishbone meal

TS254.9

A

1002-6630(2013)03-0193-05

2011-10-16

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-49)；廣東省科技計劃項目(2011A020102005；2009A020700004)；茂名市科技計劃項目(2011A01002)

馬海霞(1977—)，女，助理研究員，碩士，研究方向為水產品加工與綜合利用。E-mail：haixiam@gmail.com

*通信作者：楊賢慶(1963—)，男，研究員，本科，研究方向為水產品加工與質量安全。E-mail：yxqgd@163.com