雙酶法制備花生抗氧化肽

熊 柳，趙云霞，孫慶杰*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

雙酶法制備花生抗氧化肽

熊 柳，趙云霞，孫慶杰*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109)

研究堿性蛋白酶(Alcalase)和風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)分步水解花生粕制備花生抗氧化活性肽的工藝條件。結(jié)果表明：Alcalase的添加量為0.048AU/g pro，其最佳的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，pH值為8.0、酶解時間180min、酶解溫度60℃。然后向Alcalase水解液中添加Flavourzyme，添加量為15LAPU/g pro，pH值為7.0、酶解溫度50℃、酶解時間180min。在此條件下，花生抗氧化肽得率為90.28%，體系水解度達(dá)33.73%，所得花生肽分子質(zhì)量在5000D以下的為96.92%，具有顯著的抗氧化活性。

花生；水解；活性肽；堿性蛋白酶；風(fēng)味蛋白酶；正交試驗

花生俗稱香果、地果、落花生，為豆科植物花生種子，主要生長在熱帶和亞熱帶以及地中海沿岸[1]。是世界上六大油料作物之一，約占世界植物油料年產(chǎn)量的14%，種植面積僅次于油菜，居油料作物第二位。花生因其香脆味美，營養(yǎng)豐富，具有補(bǔ)虛、益壽、抗衰老、美容的功能因而被人們譽為“長生果”[2]。在國外，花生的營養(yǎng)保健價值備受人們的青睞，被譽為“植物肉”和“綠色牛乳”。我國花生生產(chǎn)分布范圍非常廣泛，主要集中在山東、河南、河北、安徽等省份，占全國花生產(chǎn)量的60%以上。每年，我國花生產(chǎn)量為1000萬t左右，位居世界第1位，約占全球花生總產(chǎn)量的38%[3]。花生粕是花生仁經(jīng)壓榨煉油后的副產(chǎn)品，花生榨油后的花生粕中含蛋白質(zhì)44%以上，這一寶貴的蛋白質(zhì)大部分作動物飼料利用。國內(nèi)外研究表明[4-5]，花生蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后得到的肽類具有特殊的生理功能，如抗高血壓、抗氧化作用、改善元素吸收和礦物質(zhì)運輸、激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、降膽固醇、抑制細(xì)菌、病毒和抗癌作用、促進(jìn)生長等。

短肽的制備通常采用蛋白質(zhì)酶解法[6]。陳麗花等[7]以大豆粕中蛋白為底物，利用堿性蛋白酶水解制備大豆抗氧化肽，得出最佳水解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶底比0.7%、pH8.5、溫度50℃、酶解時間4h。Meng Xianju等[8]利用堿性蛋白酶水解制備大豆活性肽，研究表明大豆活性肽能夠清除體內(nèi)自由基，能夠保護(hù)紅細(xì)胞細(xì)胞膜，并阻止由于脂肪過氧化反應(yīng)造成的細(xì)胞膜的損壞。Gao Dandan等[9]采用中性蛋白酶制取棉籽抗氧化肽，溫度為50℃、pH7.5、酶添加量為6000U/g條件下水解4h，在此條件下，水解度為24.84%。Zhang Junhui等[10]研究了堿性蛋白酶、糜蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶水解大米胚乳蛋白制備抗氧化肽，結(jié)果表明中性蛋白酶為最佳的水解酶。目前關(guān)于花生肽研究較少，王建化等[11]采用Alcalase及Neutrase蛋白酶酶解花生粕中的蛋白，制取花生抗氧化活性肽。在相同條件下，通過測定水解度得出Alcalase的水解效果比Neutrase好。李瑞等[12]比較了Alcalase酶、N120P及復(fù)合蛋白酶對花生粕中蛋白質(zhì)的酶解效果，證明復(fù)合蛋白酶效果最好，確定復(fù)合蛋白酶的最佳條件：酶用量1800U/g、酶解時間90min、酶解溫度55℃、pH 6.0、料液比1:9(m/m)。

前期實驗只確定了Alcalase和Flavourzyme蛋白酶復(fù)合對花生粕水解制備花生抗氧化肽的效果最好，本實驗對Alcalase和Flavourzyme蛋白酶復(fù)合水解花生粕制取花生抗氧化肽的工藝條件的優(yōu)化等進(jìn)行研究，得到雙酶法制取花生抗氧化肽的最優(yōu)工藝參數(shù)，為進(jìn)一步研究花生抗氧化肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫花生粕 青島長壽食品有限公司。

Alcalase堿性蛋白酶(2.4AU/g)、Flavourzyme (500LAPU/g) 丹麥諾維信(中國)投資有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

精密酸度計 上海理達(dá)儀器廠；LXJ-IIB型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；膜分離設(shè)備 北京膜分離技術(shù)科技儀器公司；752型紫外分光光度計 北京光譜儀器有限公司；RW20.n型懸臂式攪拌機(jī) 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生活性肽的制備

花生粕粉碎后過60目篩，稱取一定量的花生粕粉加入適量的水配成10%的花生粕懸浮液，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿，加入Na2SO3煮沸，冷卻后加入蛋白酶，在一定的條件下水解一段時間后升高溫度進(jìn)行滅酶處理，然后3000r/min離心分離10min，即得到花生蛋白水解液，40℃干燥即得花生活性肽。

1.3.2 花生活性肽水解度的測定

參照文獻(xiàn)[13]采用pH-stat法。

式中：DH為水解度/%；V為堿液體積/mL；cb為堿液的濃度/(mol/L)；α為α-氨基的解離度；mP為底物中蛋白質(zhì)總量/g；htot為底物中蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)/(mmol/g)，對花生蛋白而言，htot=7.13mmol/g(根據(jù)花生蛋白的氨基酸組成計算得到)。

1.3.3 短肽得率測定

短肽得率采用三氯乙酸-可溶性氮(TCA-NSI)法測定[14]。計算公式如下：

式中：m1為在10g/100mL TCA中可溶性氮質(zhì)量/mg；m2為原料中總氮質(zhì)量/mg。

1.3.4 花生活性肽的分離

將待超濾的花生蛋白肽溶液配成10mg/mL的溶液，倒入裝液筒中。超濾所用膜選用分子質(zhì)量為5000D的膜[15]，超濾的操作壓力為，料液比5%～7.5%，操作溫度40℃。超濾完畢后，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，然后稱質(zhì)量，得分子質(zhì)量≤5000D的花生活性肽含量。

1.3.5 花生活性肽抗氧化活性的測定

1.3.5.1 加速貯藏實驗

為了快速得出實驗結(jié)果，對照組對大豆油進(jìn)行了60℃條件下加速貯藏實驗，據(jù)貨架壽命系數(shù)可計算出60℃條件下保藏2d相當(dāng)于20℃條件下保藏1個月。

1.3.5.2 抗氧化活性的測定

根據(jù)GB/T 5538—1995《油脂過氧化值測定》的方法。采用Schaal烘箱法，取100mL大豆油放入250mL燒杯中，添加油質(zhì)量0.10%的抗氧化肽，放置60℃鼓風(fēng)烘箱強(qiáng)化保存，每天取樣，用碘量滴定法測定油樣的過氧化值(POV)，觀察油樣的抗氧化變化趨勢。以空白為對照評價幾種分子質(zhì)量的抗氧化肽對大豆油的抗氧化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alcalase和Flavourzyme蛋白酶復(fù)合水解最佳工藝條件的確定

2.1.1 Alcalase水解最佳工藝條件的確定

圖1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on peanut meal hydrolysis by alcalase

在酶種確定的情況下，影響蛋白質(zhì)的DH的因素有底物濃度、酶解溫度、pH值、酶解時間等[16]。以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、pH8.0、酶解溫度55℃、酶解時間180min、加酶量0.048AU/g pro為參考條件，改變?nèi)我庖蛩刈兓荻龋孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，酶解溫度45、50、55、60、65、70℃，酶解時間為60、90、120、150、180、210、240min，加酶量0、0.02、0.04、0.06、0.08AU/g pro進(jìn)行單因素試驗，對Alcalase水解花生粕中的蛋白制備花生抗氧化活性肽的工藝條件的確定，結(jié)果如圖1所示。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～10%范圍內(nèi)，花生蛋白-Alcalase體系存在明顯的底物抑制現(xiàn)象，即隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加DH下降。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時，DH為16.95%，比底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時低0.35%，比底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%時高1.75%，可見底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)從4%增加至6%時，DH下降幅度較大。從理論上來說，體系底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大會造成體系中的有效水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，因此就降低了底物和蛋白酶的擴(kuò)散和運動，從而對水解產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過低時，會降低蛋白酶和作用底物的碰撞機(jī)率，使水解反應(yīng)受到抑制[17]。從實驗結(jié)果看1%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)盡管降低了底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但體系的有效水分濃度更高，底物與蛋白酶的運動更加激烈，因此綜合考慮1%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)并未降低蛋白酶與底物的碰撞幾率。即在1%～10%的取值范圍內(nèi)，只體現(xiàn)出了高質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解反應(yīng)的抑制，并未表現(xiàn)出低質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解反應(yīng)的抑制。在實際生產(chǎn)中原料蛋白濃度過低造成產(chǎn)品絕對產(chǎn)量低，在處理量一定的條件下，必須通過反復(fù)生產(chǎn)來增大產(chǎn)品產(chǎn)量，這就使生產(chǎn)過程中能耗增加、設(shè)備利用率降低，因而底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低沒有實際意義。最終實驗選擇底物最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

pH值對酶促反應(yīng)的影響最有意義的便是它能后影響酶分子上一些氨基酸側(cè)鏈的解離狀態(tài)，特別是酶催化活性所需的側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性[18]。對于一種酶，它通常有適宜的pH值范圍。由圖2可見，隨著pH值的升高，體系水解度迅速增大，當(dāng)體系pH值達(dá)到8.0時，水解度為16.25%；當(dāng)體系pH值超過8.0時，水解度呈現(xiàn)下降趨勢。可見Alcalase更適合于偏堿性的環(huán)境，因此Alcalase水解花生粕的最適pH值為8.0，這與孟凡莉[19]研究結(jié)果相同。

圖2 pH值對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.2 Effect of pH on peanut meal hydrolysis by Alcalase

由于蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，酶解溫度與蛋白酶分子的穩(wěn)定性緊密相關(guān)，若反應(yīng)溫度過低，體系內(nèi)分子運動的激烈程度則會大幅降低，致使蛋白酶與底物的碰撞幾率下降；而當(dāng)反應(yīng)溫度超過一定限度時，次級鍵便極易解離，從而使得蛋白酶喪失部分或全部催化活性[20]。從圖3可以看出，當(dāng)溫度在45～55℃范圍時，體系水解度逐漸上升，其中45～50℃時上升迅速，50～55℃時上升緩慢；溫度超過55℃后，體系水解度開始呈下降趨勢，超過60℃后則開始迅速下降。因此Alcalase水解花生粕的最佳作用溫度為55℃，這與陳貴堂等[21]得出的研究結(jié)論是一樣的。

圖4 酶解時間對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on peanut meal hydrolysis by Alcalase

Alcalase水解花生粕符合一般的酶解曲線。由圖4可知，經(jīng)Alcalase酶解不同時間，花生蛋白的水解度隨酶解時間延長而增加，酶作用超過180min以后，水解度的增加趨勢減緩。前期180min內(nèi)，水解度變化最快，主要是因為酶活力高，產(chǎn)物的抑制作用小；隨著酶解時間的延長，酶活力逐漸下降，產(chǎn)物的抑制作用增加，此階段水解蛋白的量雖然增加較快，但水解度增加緩慢。因此Alcalase水解花生粕的時間為180min。

圖5 加酶量對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.5 Effect of Alcalase concentration on peanut meal hydrolysis by alcalase

由圖5可以看出，隨著Alcalase加酶量的增加，水解效果呈增加的趨勢，當(dāng)加酶量超過0.048AU/g pro時，隨著加酶量的增加，DH的上升趨勢趨于平緩，因此Alcalase的添加量定為0.048AU/g pro。

通過單因素試驗得出，Alcalase水解花生粕蛋白的最佳條件為：花生粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、pH8.0、酶解溫度55℃、酶解時間180min、加酶量0.048 AU/g pro。

為了優(yōu)化花生粕蛋白的工藝參數(shù)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗，其試驗因素水平表如表1所示。

表1 Alcalase正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1Design and results of orthogonal tests for optimizing the hydrolysis of peanut meal by Alcalase

由表1可以看出，影響花生粕蛋白水解程度的4個因素中D＞A＞B＞C，最佳水解條件為D2A3B2C2，即酶解時間為180min、酶解溫度為60℃、加酶量為0.048AU/g pro、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

由于實驗組合中未出現(xiàn)理論組合D2A3B2C2，所以進(jìn)行驗證實驗：向底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的花生粕料液中添加0.048AU/g pro的Alcalase，調(diào)pH值至8.0，在60℃條件下水解180min，此時體系水解度為18.32%。

2.1.2 Flavourzyme水解最佳工藝條件的確定

對Flavourzyme水解花生粕中的蛋白制備花生抗氧化活性肽的工藝條件的確定。因為Flavourzyme最適pH值為5.0～7.0，以pH7.0、酶解溫度50℃、酶解時間180min、加酶量15LAPU/g pro為參考條件，改變?nèi)我庖蛩卦O(shè)計梯度，pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，酶解溫度為40、45、50、55、60℃，酶解時間為60、90、120、150、180、210、240min，加酶量為0、5、10、15、20、25LAPU/g pro進(jìn)行單因素試驗。由圖6a可知，隨著pH值的增大，水解度逐漸升高，當(dāng)pH值大于7.0時，水解度開始下降，并且Flavourzyme最適pH值為5.0～7.0，因此選擇pH為7.0。由圖6b可知，隨著酶解溫度的升高，水解度逐漸升高，當(dāng)酶解溫度高于50℃時，水解度開始下降，因此選擇酶解溫度為50℃。由圖6c可知，隨著酶解時間的延長，水解度逐漸升高，當(dāng)酶解時間高于180min時，水解度上升比較緩慢，因此選擇酶解時間為180min。由圖6d可知，隨著Flavourzyme加酶量的增加水解效果呈增加的趨勢，當(dāng)加酶量超過15LAPU/g pro，隨著加酶量的增加，DH的上升趨勢趨于平緩，因此Flavourzyme的添加量定為15LAPU/g pro。

圖6 pH值(a)、酶解溫度(b)、酶解時間(c)、加酶量(d)對Flavourzyme(c), Flavourzyme concentration水解花生粕的影響Fig6 Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), hydrolysis time (d) on peanut meal hydrolysis by Flavourzyme

通過單因素試驗得出，F(xiàn)lavourzyme水解花生粕蛋白的最佳條件為：pH7.0、酶解溫度50℃、酶解時間180min、加酶量15LAPU/g pro。

表2 Flavourzyme正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal tests for optimizing the hydrolysis of peanut meal by Flavourzyme

由表2可知，影響花生粕蛋白水解程度的3個因素中B＞A＞C，最佳水解條件為B2A2C2，即酶解時間為180min、酶解溫度為50℃、加酶量為15LAPU/g pro。

對最佳水解條件進(jìn)行驗證實驗，向Alcalase水解液中添加15LAPU/g pro的Flavourzyme，調(diào)pH值至7.0，在50℃條件下水解180min，此時花生活性肽的得率為90.28%，體系水解度為33.73%。

2.2 花生活性肽分子質(zhì)量的初步測定結(jié)果

通過計算，分子質(zhì)量≤5000D的花生活性肽含量為96.92%，說明花生活性肽的分子質(zhì)量96.92%分布在5000D以下。

2.3 花生活性肽抗氧化活性的測定結(jié)果

表3 花生活性肽對大豆油POV的影響Table3 Effect of peanut antioxidant peptides on POV of soybean oil meq/kg

由表3可知，添加0.10%的花生活性肽到大豆油中，加速貯藏存放36d后，POV為9.93meq/kg，比對照大豆油POV減少78.88%，表明該花生活性肽具有良好的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

3.1 雙酶法(Alcalase和Flavourzyme蛋白酶)水解低溫花生粕的最佳工藝條件為：向4%的低溫花生粕溶液中添加Alcalase蛋白酶(添加量為0.048AU/g pro)，在60℃條件下

水解180min，然后向Alcalase水解液中添加Flavourzyme蛋白酶(添加量為15LAPU/g pro)，在50℃條件下水解180min，此時花生抗氧化肽的得率為90.28%，體系水解度為33.73%。制得的花生抗氧化肽分子質(zhì)量96.92%分布在5000D以下。

3.2 雙酶法制取的花生活性肽具有明顯的抗氧化活性，其狀態(tài)是顆粒粉末，與大豆肽相比無苦味。

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Preparation of Peanut Antioxidant Peptides Using Dual-Enzyme Method

XIONG Liu，ZHAO Yun-xia，SUN Qing-jie*
(College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Alcalase and Flavourzyme were used to hydrolyze peanut meal for the preparation of antioxidant peanut peptides and the optimal process conditions were explored. The results showed that the optimal hydrolysis conditions for alcalase were alcalase concentration of 0.048 AU/g, substrate concentration of 4%, hydrolysis pH of 8.0, hydrolysis duration of 180 min and hydrolysis temperature of 60 ℃. The optimal hydrolysis conditions for Flavourzyme were Flavourzyme concentration of 15 LAPU/g, hydrolysis pH of 7.0, hydrolysis temperature of 50 ℃ and hydrolysis duration of 180 min. Under the optimal conditions, the yield of peanut peptide was up to 90.28%, and the DH of peanut meal was 33.73%. Meanwhile, the amount of peanut peptide with molecular weight less than 5000 D was up to 96.92%. The obtained peanut peptide has obvious antioxidant activity.

peanut；hydrolysis；bioactive peptides；Alcalase；Flavourzyme；orthogonal test

TS229；TQ936.1

A

1002-6630(2013)03-0207-05

2011-12-01

山東省科技發(fā)展計劃項目(2012gnc11306)；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目(11-2-3-25-nsh)

熊柳(1975—)，女，講師，碩士，研究方向為糧油加工。E-mail：xiongliu821@163.com

*通信作者：孫慶杰(1970—)，男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂與蛋白質(zhì)工程。E-mail：phdsun@163.com