傳統風鴨中蛋白分解菌株的篩選及對鴨肉香腸品質特性的影響

王小蘭，于 海，崔保威，王 敏，谷成業，汪志君*

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127)

傳統風鴨中蛋白分解菌株的篩選及對鴨肉香腸品質特性的影響

王小蘭，于 海，崔保威，王 敏，谷成業，汪志君*

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127)

從傳統風鴨中篩選出優質蛋白分解菌株C94并應用到鴨肉香腸中，測定香腸在成熟過程中的理化指標。通過自然發酵的對照組(CK)和添加發酵劑的實驗組進行比較。結果表明：實驗組的aw值、pH值迅速降低，天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、賴氨酸等含量均有一定程度的增加，其中賴氨酸含量為135.68mg/100g，而CK組僅為37.32mg/100g。采用頂空固相微萃取(SPME)和氣質聯用(GC-MS)的方法對鴨肉香腸中揮發性風味化合物的種類和相對含量進行分析，實驗組共檢測出69種風味物質，其中醛類23種、烷烴類15種、醇類7種、酸類3種、酯類6種、酮類4種等。

風鴨；蛋白質；篩選；電泳；香腸；風味

發酵香腸主要是利用微生物的發酵作用，使其產生特殊風味、色澤和質地[1]。同時，鴨肉含水量為50%～60%，蛋白質含量比畜肉含量高約18%，鴨肉蛋白的組成中，氨基酸含量甚為豐富，利用鴨肉為原料生產出的香腸具有味道鮮美、易于吸收、攜帶方便、保存時間長等優點[2]。發酵香腸的規模化生產，關鍵是要對微生物發酵劑的研究和探索[3]，傳統發酵肉制品加工周期較長、加工過程難以控制，通過添加人工發酵劑能夠縮短生產周期，控制產品質量、提高產品質量穩定性。因此，微生物發酵劑是發酵香腸生產的關鍵因素之一[4]，本實驗通過SDS-PAGE法從傳統風鴨中篩選出優質蛋白分解菌株，并接種到鴨肉香腸中，通過自然發酵的對照組(CK組)和添加發酵劑的實驗組進行比較，測定鴨肉香腸理化指標的變化，具體分析香腸中風味化合物的種類和相對含量，初步探討葡萄球菌對香腸風味物質產生的促進作用，以期為充分利用我國豐富的菌種資源，改善發酵肉制品品質，開發具有我國自主知識產權的肉品發酵劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風鴨，購于揚州農貿市場。

蛋白胨、牛肉膏為生化純，SDS、濃硫酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、碘化汞、碘化鉀、硫酸銨、磺基水楊酸、納氏試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

eps300電泳儀 上海Unico公司；5804R高速冷凍離心機 北京艾澤信科技有限公司；KDN-04A蛋白質測定儀 上海貝特儀電設備廠；WFJ2000分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；復合式75μm Car/PDMS萃取頭美國Supelco公司；Trace氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)美國Finnigan公司；755S紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

在無菌操作條件下，取風鴨深部(距表面2.5cm處)肉，切碎，置于MSA液體培養基中，振蕩，30℃培養48h，分離純化，直至純菌落，挑取單個菌落革蘭氏染色，細胞形態鏡檢，革蘭氏陽性菌保存待用。

1.3.2 菌株全細胞懸液的制備

參照Annalisa等[5]的方法。

1.3.3 肌漿蛋白的提取

稱取肉樣10g，充分粉碎后按料液比1:10(m/V)加入0.03mol/L pH6.5的磷酸緩沖液，4℃高速均質后，同溫度下12000r/min離心20min，取上清液用8～1.5kD透析袋4℃過夜，即為肌漿蛋白[6]。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

稱取肉樣10g，充分粉碎后按料液比1:10(m/V)加入0.03mol/L pH6.5的磷酸緩沖液，4℃高速均質后，同溫度下12000r/min離心20min，棄上清液，沉淀再以1:10加入0.03mol/L，pH6.5的磷酸緩沖液，4℃、10000r/min離心20min。重復上述操作3次，然后沉淀按1:4比例加入0.1mol/L、pH6.5(含0.7mol/L KI和0.02% NaN3)的磷酸緩沖液，4℃勻漿4min，再于12000r/min離心20min，取上清液4℃透析過夜，即為肌原纖維蛋白[7]。

1.3.5 蛋白提取物接種菌株全細胞懸液

分別將100μL菌株全細胞懸液接種到400μL肌漿蛋白和肌原纖維蛋白(以下簡稱為蛋白提取物)中，對照組加入100μL 0.02mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液，37℃培養箱中發酵5～6d。

1.3.6 SDS-PAGE法檢測菌株對蛋白提取物的降解能力

參照汪家政等[8]的方法，并加以改進。濃縮膠為4%，肌漿蛋白分離膠為15%，肌原纖維蛋白分離膠為12%。

上樣：將兩種蛋白質樣品質量濃度調至1mg/mL，然后與5×樣品緩沖液(含60mmol/L Tris、2% SDS、14.4mmol/L巰基乙醇、25%甘油，用4mol/L鹽酸調pH值至6.8，加入0.1%溴酚藍)按體積比4:1混合。上樣前樣品煮沸10min，中分子質量蛋白質Marker煮沸5min，寬分子質量蛋白質Marker 40℃溫水中放置10min，樣品及蛋白質Marker上樣量均為10μL。

電泳：起始電壓80V，樣品進入分離膠后電壓調至150V，待溴酚藍到達距底線1.5cm左右時，停止電泳。

染色：加入考馬斯亮藍R-250染色液(甲醇、冰醋酸、水體積比45:10:45，并加入0.2%考馬斯亮藍R-250)，混合染色40min。

脫色：用清水清洗凝膠，加脫色液(甲醇、冰醋酸、水體積比5:5:40)，于脫色搖床上反復多次脫色。

1.3.7 所篩選菌株的安全性檢測

1.3.7.1 溶血性實驗

在普通營養瓊脂培養基中加入豬血混勻，趁熱傾倒平皿，冷卻保藏，將被檢菌株劃線接種于血瓊脂平板中，37℃倒置培養48h后，取出，觀察其菌落周圍是否產生溶血圈[9]。

1.3.7.2 動物實驗

樣品前處理：將所要檢驗的菌株活化兩代，用無菌生理鹽水調節菌體濃度106CFU/mL。

方法：用無菌注射器吸取菌液1mL注射于小鼠腹腔，觀察小鼠飲欲、食欲、活動及死亡情況，實驗期為2周。

1.3.8 水分活度的測定

參照GB/T 9695.12—1988《肉與肉制品水分活度測定》進行。稱取2g肉樣，絞碎，用精密水分活度測定儀進行測定。

1.3.9 pH值的測定

參照GB 9695.5—1988《肉與肉制品pH測定》進行。取5g樣品，用研缽研碎，加入50mL中性的蒸餾水，振蕩30min，過濾，濾液用pH計測定。

1.3.10 游離氨基酸含量的測定

取鴨肉香腸10g，加入8%的磺基水楊酸10mL，高速均質機均質后，4℃、10000r/min離心20min，取上清液過濾，4℃、20000r/min離心15min，取上清液于氨基酸自動分析儀檢測。

1.3.11 揮發性風味化合物的提取

分別取實驗組和對照組發酵后期的肉樣，密封后于—20℃保藏備用。測試前將冷凍鴨肉香腸切成薄片，迅速置于液氮罐中，0.5h后取出磨成粉末，準確稱取4.0g放入15mL萃取瓶，蓋上蓋子，密封備用。

萃取頭第一次使用時在氣相色譜進樣口老化2h，老化溫度為250℃，載氣體積流量為0.8mL/min，分流比為50:1。將復合式75μm Car/PDMS萃取頭插入密封的樣品瓶，推出萃取頭，使其暴露在瓶內樣品上部的頂空中，60℃萃取90min，然后將萃取頭插入氣相色譜進樣口于250℃解吸2min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數據[10]。

1.3.12 揮發性風味物質的鑒定

用氣質聯用儀(GC-MS)進行風味物質鑒定。氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-5MS，長60m，內徑0.32mm，涂層厚1μm。載氣為He，不分流，恒流12mL/min；進樣口溫度為250℃；進樣口溫度250℃，解析2min。

程序升溫：起始溫度40℃保持1min，以50℃/min升至130℃，80℃/min升至200℃，12℃/min升至250℃，保持7min，GC與MS接口溫度為250℃。

質譜條件：離子源為EI源，溫度為200℃，接口溫度為250℃，檢測器電壓350V，發射電流150μA，掃描范圍33～500u。

1.3.13 揮發性風味物質的定性和定量

定性：化合物經計算機檢索，與NIST library(170 k compounds)相匹配，相似指數(SI)800以上為確認化合物(最大值為1000)。

定量：相對百分含量按峰面積歸一化計算。用SAS9.1.3軟件對實驗數據進行分析[11]。

2 結果與分析

2.1 風鴨中蛋白分解菌株的分離與純化

從自然發酵風鴨中分離純化得到157株單菌株，經革蘭氏染色和顯微鏡觀察，篩選出革蘭氏陽性的純菌株59株，不產生溶血圈、血漿凝固酶陰性的菌株50株，注射菌液的實驗小鼠無不良反應，表明所篩選葡萄球菌為非致病性菌株，可以作為肉制品發酵劑的備選菌株。

2.2 風鴨中蛋白降解菌株的初篩

將菌株全細胞懸液分別接種到肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中，對每個發酵樣進行SDS-PAGE分析，篩選出蛋白降解能力強的菌株，初步篩選出菌株C1、C2、C22、C41、C82、C86、C94和C116對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均有較強的降解能力。

2.3 風鴨中蛋白降解菌株的復篩

由圖1可知，將不同的菌株接種到肌漿蛋白提取物中，37℃發酵5～6d后，對照組和實驗組樣品的蛋白質片段均發生一定程度的降解。CK組分子質量大于45kD的蛋白質降解明顯，但20kD左右的低分子質量蛋白質降解不明顯；接種C82的實驗組31kD左右的蛋白質片段降解明顯，40kD附近的條帶顏色加深，說明該蛋白濃度增加；接種C86的實驗組20kD左右的低分子質量蛋白質降解程度比C82實驗組加劇；接種C22的肌漿蛋白降解相對不明顯；接種C41、C116和C1的肌漿蛋白降解情況相似。接種C41的肌漿蛋白分子質量在14.4～20kD之間有一條帶降解不明顯；接種C94的肌漿蛋白降解情況最為明顯，各分子質量蛋白均有不同程度的降解，分子質量大于45kD的蛋白幾乎完全降解，20kD左右的蛋白片段降解成14.4kD左右的小分子片段，31kD附近蛋白條帶顏色變淺。

圖1 接種不同菌株的肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein hydrolyzed by Staphylococcus strains

圖2 不同菌株處理肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of myofibrillar protein hydrolyzed by Staphylococcus strains

由圖2可知，將不同的菌株接種到肌原纖維蛋白提取物中，37℃發酵5～6d，和CK組相比，接種C82的肌原纖維蛋白分子質量為20kD的條帶發生降解；接種C41、C116和C1的蛋白降解情況相似，其分子質量在40kD以下的蛋白條帶均發生明顯的降解，分子質量在50kD左右的蛋白質片段幾乎消失；同樣接種C94的肌原纖維蛋白降解情況最為明顯，大于120kD的大分子蛋白質片段明顯減弱，生成了100～120kD之間的小分子片段，這是其他菌株所沒有的作用效果，50kD處的蛋白條帶也發生明顯的降解，40kD處的條帶顏色明顯減弱。綜合菌株對肌漿和肌原纖維蛋白的降解情況，最終選擇菌株C94作為香腸發酵劑的目標菌株。

2.4 鴨肉發酵香腸的理化成分分析

2.4.1 香腸成熟過程中水分活度的變化

由圖3可知，水分活度在發酵過程中呈下降趨勢。實驗組和CK組最初水分活度值在0.9左右，CK組水分活度一直處于平緩下降趨勢，發酵13d后實驗組水分活度下降速度加快，發酵結束后，實驗組水分活度降為0.8190，CK組為0.8595，實驗組水分活度值顯著低于CK組(P＜0.05)，低水分活度的環境能夠更加有效抑制腐敗微生物的生長，對香腸的保藏起到較好的作用。

圖3 鴨肉香腸生產過程中水分活度變化Fig.3 Change of water activity during the fermentation process of duck sausage

2.4.2 香腸成熟過程中pH值的變化

圖4 鴨肉香腸生產過程中pH值的變化Fig.4 Change of pH during the fermentation process of duck sausage

由圖4可知，隨著發酵期的延長，鴨肉香腸的pH值逐漸下降，且pH值的降低主要發生在發酵前期(0～9d)，尤其前3d的下降速率最快，到發酵后期(15～21d)pH值的下降趨于平緩，發酵結束時，實驗組pH值顯著低于CK組(P＜0.05)，實驗組發酵20d后，pH值略有回升主要是因為在微生物的作用下，蛋白質水解產生的氨等堿性緩沖物質累積引起的。

2.4.3 香腸成熟過程中游離氨基酸含量的變化

圖5 鴨肉香腸發酵末期游離氨基酸的含量Fig.5 Amounts of free amino acids in fermented duck sausage

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白先被降解成多肽，然后多肽在肽酶作用下降解成小肽，小肽在氨肽酶的作用下最終形成游離氨基酸。游離氨基酸是香腸重要的滋味物質，而且某些氨基酸可以參與氨基酸代謝生成支鏈的醛，是香腸重要的風味物質，鴨肉香腸發酵成熟后期實驗組和對照組游離氨基酸的含量見圖5。香腸發酵結束后，實驗組游離氨基酸總量與CK組相比顯著增加(P＜0.05)，實驗組的游離氨基酸總量為3375.06mg/100g，CK組為3024.91mg/100g，其中實驗組胱氨酸(Cys)含量降低不顯著(P＞0.05)，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)以及賴氨酸(Lys)這4種氨基酸的含量顯著高于對照組(P＜0.05)，甘氨酸(Gly)含量增加不顯著(P＞0.05)，從占總游離氨基酸的相對含量來看，比CK組增加比例分別為天冬氨酸(0.93%)、谷氨酸(1.22%)、酪氨酸(0.07%)、賴氨酸(2.79%)。

2.4.4 香腸成熟過程中揮發性風味物質分析

發酵香腸最終風味的形成是眾多風味物質綜合作用的結果，如蛋白質降解生成的氨基酸、微生物代謝和脂肪氧化生成的芳香化合物。通過固相微萃取和氣質聯用(SPME-GC/MS)來分析CK組和實驗組香腸中揮發性風味化合物，具體分析結果見表1。

表1 鴨肉香腸中揮發性風味物質的相對含量Table1 Relative contents of volatile flavor compounds in fermented duck sausage

續表1

續表1

由表1可知，添加發酵劑的實驗組共檢測出69種風味物質，包括醛類23種、烷烴類15種、醇類7種、酸類3種、酯類6種、酮類4種、醚類1種和其他10種；CK組共檢測出68種風味物質，包括醛類20種、烷烴類14種、醇類8種、酸類9種、酯類7種、酮類1種、醚類1種和其他8種。其中實驗組醛類物質相對含量最高，為68.12%，是重要的風味貢獻物質，主要為壬醛、2,4-癸二烯醛、辛醛；實驗組的酯類物質相對含量明顯增加，主要為10-甲基-8-十四烯乙酯和異膽酸乙酯。Berdague等[12]研究表明一些酯類物質如丙酸乙酯、醋酸丙酯、丁酸乙酯來自碳水化合物的代謝發酵過程；由此可知，葡萄球菌C94一定程度上促進酮類、醇類、烷烴類、醛類和其他一些氨基酸鏈的產生，同時酸類物質明顯減少。

酮類一般由美拉德反應、酯類降解、氧化或進一步反應生成。由表1可知，酮類物質在揮發性風味物質中所占的相對含量不到2%，因此酮類物質對香腸最后的風味影響不大[13]。醇類物質的產生一方面來自香腸自身化學降解[14]，一方面由于微生物的代謝產生。酯類物質是發酵香腸典型風味所必需的，它們多帶有芳香味[15]，酯類的形成通常需要一個復雜的反應鏈，它們來自微生物作用下醇類和酸類的酯化反應。

3 結 論

葡萄球菌具有硝酸鹽還原酶、過氧化氫酶以及蛋白酶和脂肪酶活性，對發酵香腸的色澤、風味都起到重要作用，本實驗從傳統風鴨中分離、純化單菌落，再初步篩選出革蘭氏陽性、安全無毒的菌株50株，采用SDSPAGE凝膠電泳法測定上述菌株對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解情況，最終篩選到蛋白降解能力最強的菌株C94，將菌株C94接種到鴨肉香腸中，實驗結果表明葡萄球菌C94迅速降低香腸的pH值、aw值，更好的保障鴨肉香腸的安全性，使得葡萄球菌成為其中的優勢菌。實驗組中氨基酸總量顯著增加(P＜0.05)，這是因為葡萄球菌具有蛋白酶活性，將鴨肉中的蛋白質降解產生大量游離氨基酸，氨基酸又進一步降解為支鏈的醛、醇、酮等，促進風味物質的形成，這與實驗組檢測出的豐富的風味物質相一致，實驗組檢測出69種風味物質，其中醛類占68.12%。因此，在香腸中接種蛋白降解菌株C94對香腸品質提高起到非常重要的作用。

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Screening of Protein Hydrolysis Strain from Air-dried Duck and Its Application in Fermented Duck Sausage

WANG Xiao-lan，YU Hai，CUI Bao-wei，WANG Min，GU Cheng-ye，WANG Zhi-jun*
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

In this study, the strain C94with the function of protein hydrolysis was screened from traditional air-dried duck and applied in duck sausage. The physical and chemical indicators of the sausage during the process of maturation were determined. Compared with naturally fermented group (CK) with Saprophytic staphylococcus fermented duck sausages, the awand pH of C94fermented duck sausages revealed a rapid decrease, however, the amount of aspartic acid, glutamic acid, tyrosine and lysine revealed an obvious increase. The amount of lysine was up to 135.68 mg/100 g in C94fermented duck sausages, and was only 37.32 mg/100 g in the CK group. The types and amounts of volatile compounds in Saprophytic staphylococcus fermented duck sausages was analyzed by solid phase microwextractiongas chromatography (SPME/GC-MS). Totally 69 kinds of flavor substances were identified in Saprophytic staphylococcus fermented duck sausages, which included 23 kinds of aldehydes, 15 kinds of hydrocarbons,7 kinds of alcohols,3 kinds of acids,6 kinds of esters,4 kinds of ketones and others.

air-dried duck；protein；screen；electrophoresis；sausage；flavor

TS251.5

A

1002-6630(2013)03-0222-06

2011-10-31

江蘇省科技支撐計劃項目(BE2009367)；江蘇省自然科學基金項目(BK2008212)；揚州大學“新世紀人才工程”項目

王小蘭(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物資源開發利用。E-mail：wangxiaolan1211@163.com

*通信作者：汪志君(1949—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物資源開發利用及肉制品加工。E-mail：zjwang@yzu.edu.cn