不同年齡段人血清中酸性肽的HPLC分析

謝江濤，安玉會，王潔瓊，賀司宇，毛紅利，施佳辰，徐 霞

(鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室 河南鄭州 450001)

在早老性癡呆病(Alzheimer’s disease，AD)第一個臨床癥狀出現之前的20～30 a中，神經退行性改變就已開始。因此，尋找和發現用作早期預警的生物標志物，預先發現神經退行性改變對于老年癡呆病的預防和治療以及預后都有重要的臨床意義［1］。當前，老年癡呆病的生物標志物研究主要聚焦于血液和腦脊液這兩種體液中的肽和蛋白質上［2］。尤其是血液樣品，容易獲得，對人體傷害小，比腦脊液具有更大的臨床應用價值［3］。β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，A)和tau蛋白是兩種公認的引起神經退行性改變的病因學分子。在AD病人腦脊液中β-淀粉樣肽的水平降低，而tau蛋白水平增加［4］。盡管測定人血液中tau蛋白水平意義巨大，但tau蛋白釋放到血中的量比急性中風病人要低很多［3］。因此，tau蛋白在血中的水平作為老年癡呆病的生物標志物尚不夠理想。血中β-淀粉樣肽的水平測定顯示，AD病人組和正常對照組人群血中Aβ40和Aβ42的水平不存在有意義的差異［5］。為了從血液中尋找神經退行性改變的早期預警性生物標志物，對不同年齡人群血清中酸性肽的含量進行了HPLC分析。

1 材料與方法

1.1 血清樣品的收集和分組處理 收集2010年10月至2011年10月來鄭州大學第一附屬醫院抽血化驗的不同年齡人群的血清樣品，排除有腦疾病，血液疾病和傳染病的血清樣品并凍存于－80℃冰箱。按年齡大小將血樣分為1～10歲組(A組)，20～30歲組(B組)，40～59歲組(C組)和60～80歲組(D組)4組。每個血清樣品分別抽取1 ml放入干鍋瓶中，60℃烘箱過夜烘干。加入含有酸性肽內標的生理鹽水1 ml徹底溶解后轉移至離心管中，10 000 r/min離心5 min。收集上清液備用。

1.2 血清樣品的HPLC分析 按照Chakraborty AB等人［6］介紹的方法進行分析。HPLC儀為:Agilent 1 200/ 1 100LC(美國安捷倫公司制造)。HPLC柱為:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)。洗脫液甲醇。流速0.5 ml/min。測定波長225 nm。進樣量10 μl。

1.3 統計學分析 HPLC分析所獲得的樣品和內標的積分面積用以下公式計算出酸性肽的含量。

酸性肽的含量(mg/ml)=(樣品的積分面積-內標的積分面積)/內標的積分面積×內標的含量(mg/ml)

數據用SPSS12.0進行統計學分析，各組數據分別與1～10歲組比較，進行t檢驗分析。不同年齡組的組內進行F檢驗分析，數據用±s表示。組間數據比較用t檢驗。檢驗水準取α=0.05。

2 結果

2.1 單獨內標(酸性肽純品)的HPLC圖 見圖1。

圖1 內標(酸性肽純品)的HPLC圖

2.2 血清樣品(含有內標)的HPLC圖 見圖2。

2.3 血清樣品的HPLC分析結果 血清樣品經HPLC分析，其酸性肽的含量列于表1中。

圖2 血清樣品(含有內標)的HPLC圖

表1 血清樣品經HPLC分析后酸性肽的含量(±s)

表1 血清樣品經HPLC分析后酸性肽的含量(±s)

總F=2.898，P﹤0.05。

?

3 討論

酸性肽是本實驗室分離純化獲得的一個新的小分子神經肽［7］。HPLC分析的結果顯示，20～30歲組和40～59歲組人群血清中酸性肽的含量比1～10歲組人群血清中酸性肽的含量明顯降低。統計學分析表明，20～30歲組和40～59歲組人群血清中酸性肽的含量與1～10歲組分別比較，差異均有顯著性。這說明隨著人體的成熟，成年人血清中酸性肽的含量比少兒時人血清中酸性肽的含量是減少的。而當超過60歲以后，人血清中酸性肽的含量明顯升高，與1～10歲組人群血清中酸性肽的含量基本相似。因此，60～80歲組人群血清中酸性肽的含量與1～10歲組比較，差異無顯著性。這說明少兒人群和老齡人群血清中酸性肽的含量相似。少兒人群和60歲以上的老齡人群是神經功能較為低下的兩個年齡段。尤其是老齡人群，隨著機體的衰老，其腦內酸性肽釋放到血液中的速度可能增加。因而腦內酸性肽的含量就可能降低，從而導致腦內酸性肽抑制APP，BACE(B-site APP cleaving enzyme)和tau蛋白產生的能力降低［8］，也由此降低了酸性肽抑制神經元凋亡的能力［9］，最終也就導致了腦的退行性事件的發生。

APP(amyloid precursor protein)是存在于神經細胞膜上的β-淀粉樣前體蛋白。APP經β分泌酶(即BACE)和γ分泌酶水解形成β-淀粉樣肽［10］。β-淀粉樣肽主要沉積于神經細胞外，損傷并導致神經元的凋亡和丟失［11］。另外，由于β-淀粉樣肽的瀑布效應，就會啟動tau蛋白的過度磷酸化，在神經細胞內形成神經纏絲，這就會進一步加速神經元的凋亡和神經退行性的發生和發展［12］。

HPLC分析已經廣泛應用于小分子化合物和各種肽類化合物的分析純化［13，14］，并在蛋白質組學研究中應用［15］。本研究采用內標法和高效液相色譜分析法測定了人血清中酸性肽的含量，獲得了良好的結果。但老年癡呆病人及其家族聚集人群血中酸性肽的含量需要進一步分析研究。

［1］ Humpel C，Hochstrasser T.Cerebrospinal fluid and blood biomarkers in Alzheimer’s disease［J］.World Journal of Psychiatry，2011，1 (1):8-18.

［2］ Aluise C D，Sowell R A，Butterfield D A.Peptides and proteins in plasma and cerebrospinal fluid as biomarkers for the prediction，diagnosis，and monitoring of therapeutic effecacy of Alzheimer’s disease［J］.Biochem Biophys Acta，2008，1782(10):549-558.

［3］ Hampel H，Blennow K，Shaw L M，et al.Total and phosphorylated tau protein as biolgical makers of Alzheimer’s disease［J］.Exp Gerontol，2010，45(1):30-45.

［4］ Tapiola T，Alafuzoff I，Herukka S K，et al.Cerebrospinal fluid betaamyloid 42 and tau proteins as biomarkers of Alzheimer-type pathological changes in the brain［J］.Arch Neurol，2009，66(3):382-389.

［5］ Frankfort S V，Tulner L R，van Campen J P，et al.Amyloid beta protein and tau in cerebrospinal fluid and plasma as biomarkers for dementia:a review of recent literature［J］.Curr Clin Pharmacol，2008，3(2):123-131.

［6］ Chakraborty A B and Berger S J.Optimization of reversed-phase peptide liquid chromatography ultraviolet mass spectrumetry analyses using an automated blending methology［J］.Biomol Tech，2005，16 (4):327-335.

［7］ 安玉會，劉莊勵，王占國，等.一個新的牛神經肽—牛酸性神經肽1的測序［J］.河南醫科大學學報，1998，33(4):5-7.

［8］ 安玉會，宋丹，趙巖，等.酸性肽對血管性癡呆小鼠學習記憶力和腦組織APP、BACE和tau蛋白表達的影響［J］.鄭州大學學報(醫學版)，2011，46(2):204-208.

［9］ 安玉會，毛紅利，馬紅霞，等.酸性肽對神經元凋亡的抑制作用［J］.中國組織工程與臨床康復研究，2007，11(17):3457-3460.

［10］Zhang Y W，Xu H.Molecular and cellular mechanisms for Alzheimer’s disease:understanding APP metabolism［J］.Curr Mol Med，2007，7 (7):687-696.

［11］Tomiyama T.Involvement of beta-amyloid in the etiology of Alzheimer’s disease［J］.Brain Nerve，2010，62(7):691-699.

［12］Huang H C，Jiang Z F.Accumulated amyloid-beta peptide and hyperphosphorylated tau protein:relationship and links in Alzheimer＇s disease［J］.J Alzheimers Dis，2009;16(1):15-27.

［13］Cullhane J C，Wang D Q，Yen B P M，et al.Comparative analysis of small molecules and histone substrate analogs as LSD1 lysine demethylase inhibitors［J］.J Am Chem Soc，2010，132(9):3164-3176.

［14］Chen Y X，Mant C T，Hodges R S.Preparative reversed-phase highperformance liquid chromatography collection effeciency for an antimicrobial peptide on columns of varying diameters(1mm to 9.4mm I.D.)［J］.J Chromatogr A，2007，1140:112-120.

［15］Zhang J，Wu S L，Kim J，et al.Ultratrace liquid chromatography/ mass spectrometry analysis of large peptides with post-translational modifications using narrow-bore poly(styrene-divinylbenzene)monolithic columns and extended range proteomic analysis［J］.J Chromatogr A，2007，1154(1-2):295-307.