驚厥發(fā)作不同時相下腦紅蛋白表達的初步研究

劉廣韜，潘隆盛，尚愛加，劉 策，伍 剛，李雙彥，周敬安(解放軍第309醫(yī)院神經外科，北京 0009;解放軍總醫(yī)院神經外科;通訊作者，E-mail:shangaij@63.com)

癲癇是神經系統(tǒng)疾病中常見的發(fā)作性疾病，作為高耗氧、低氧儲備的腦細胞對于缺氧的耐受力極弱。在癲癇發(fā)作過程中所致的缺氧間接導致的腦損傷也越來越多地被關注［1］。腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是德國學者Burmester等［2］在2000年首先在人和小鼠腦內發(fā)現的一類繼血紅蛋白(hemoglobin，Hb)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)外的第三類攜氧球蛋白。NGB與氧親和力高，能可逆性地結合氧并特異性地向腦組織供氧，增強腦組織對氧的利用率。NGB的表達強度與腦組織缺氧損傷程度負相關，是一種內源性神經保護因子［2］。本研究采用經硬腦膜電刺激致大鼠驚厥模型，觀測不同時相下大鼠驚厥后大腦皮層NGB的表達變化情況，旨在探討與缺氧性腦損傷密切相關的癲癇驚厥發(fā)作和NGB表達之間的相應變化關系及NGB在驚厥發(fā)作時的腦保護作用和意義。

圖1 大鼠驚厥發(fā)作后CA1區(qū)細胞HE染色形態(tài)學表現 (×100)Fig 1 Morphology of hippocampus cells in CA1 area after seizure by HE staining (×100)

圖2 癲癇不同時點額葉皮層NGB免疫組化染色結果 (×400)Fig 2 HGB immunohistochemical staining results of NGB expression in cortex after seizure for different time (×400)

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性SPF級SD大鼠25只，體重240-280 g，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(京)2006-0009，北京維通利華實驗動物技術有限公司，光暗周期12 h，環(huán)境溫度(20±2)℃。隨機分為:假手術組，5 min組，15 min組，30 min組，30 min延遲組(發(fā)作 30 min后延遲1 h取材)，每組5只。

1.1.2 試劑及器材 一抗:小鼠抗大鼠NGB單克隆抗體(編號:IE12)，工作濃度1∶100(軍事醫(yī)學科學院提供)。免疫組化染色試劑盒:Histostain-Plus Kit LAB-SA Detection System(Cat.No.85-6643，SUNBIO公司)，其中含試劑A(藍色液體):封閉用正常山羊血清工作液;試劑B(黃色液體):生物素化二抗工作液;試劑C(橙色液體):辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。二氨基聯(lián)苯胺試劑盒(Diaminobenzidine，DAB)Kit(Cat.No.00-2014，SUN BIO 公司)，10%中性甲醛(pH7.3)，0.01 mol/L(pH7.5)磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate-buffer saline，PBS)，0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(Citratebuffersolution，CB)，多聚賴氨酸，蘇木素染液(Mayer法)。包埋機:KD-BM生物組織包埋機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司;切片機:LEICA2016，德國;顯微鏡:Nikon i50，日本;水浴鍋:SHA-C，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司。刺激器:日本光電工業(yè)株式會社，型號:SEN-7103。分離器:日本光電工業(yè)株式會社，型號:SS-102J。小動物腦電圖記錄儀:Neurocop，型號:UE-16A。

1.2 方法

1.2.1 腦組織標本取材 參考Voskuyl等［3］方法建立大鼠電刺激致癇模型，10%水合氯醛按0.4 ml/100 g進行腹腔注射麻醉，臺式牙科電鉆分別于左右兩側冠狀縫前3 mm、中線旁開3 mm位置鉆骨孔植入電極，固定后縫合頭皮備用。發(fā)作強度以到達Racine［4］Ⅳ-Ⅴ級，腦電圖出現尖波、棘波及棘(尖)慢復合波等異常放電波形為造模達標。根據實驗設計通過電流控制發(fā)作時間，各組大鼠于相應時間點快速斷頭取腦，假手術對照組僅行電極植入手術但不進行電刺激，于術后24 h取材。取材后標本浸泡于4%多聚甲醛PBS溶液中4℃冰箱過夜。取材:囟門后2.8 mm做冠狀切面，自切面向頭側3 mm作另一切面取材。置4%多聚甲醛PBS溶液再固定18 h后石蠟包埋、切片(厚度4 μm)，然后分別進行HE染色及免疫組化染色。

1.2.2 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，無水乙醇5 min ×2，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，流水沖洗15 min;蘇木素染色液3 min;自然水洗，1%鹽酸乙醇化數秒;流水沖洗、溫水10 min;0.5%伊紅乙醇染色液1-2 min;50%乙醇適當脫水;75%乙醇脫水數秒;85%乙醇脫水數秒;95%乙醇脫水數秒;100%乙醇脫水;二甲苯透明5 min×2次;中性樹脂封片;鏡下觀察結果。

1.2.3 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;抗原修復:將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內，加熱至產生噴氣，并持續(xù)2 min，壓力鍋離開熱源;取出并恢復至室溫，PBS沖洗;3%H2O2去離子水孵育20 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗;滴加試劑A室溫孵育10-15 min;滴加適當比例稀釋的一抗NGB(1∶100)放入濕盒內4℃過夜;取出并恢復至室溫，PBS沖洗;滴加試劑B，室溫或37℃孵育10-15 min;PBS沖洗后滴加試劑C，室溫37℃孵育15 min;PBS沖洗，DAB顯色劑顯色;自來水充分沖洗;蘇木素復染，脫水，透明;中性樹脂封片。

1.2.4 圖像分析 每個標本選取5張切片進行圖像分析。經光學顯微鏡200倍放大倍率下，選取額葉皮層4個不同視野區(qū)域進行顯微攝影拍照。使用由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)開發(fā)的Image J(版本1.42q)軟件進行分析處理后，由軟件計數照片中的陽性細胞數量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 經硬腦膜電刺激致驚厥發(fā)作后腦組織HE染色形態(tài)學表現

各發(fā)作組腦組織大體標本無肉眼可見改變，體積、形態(tài)與正常對照腦組織無可見差異。HE染色后，假手術組(圖1A，見第323頁)與驚厥發(fā)作(圖1B，見第323頁)各時相組未見明顯差異，光鏡下見皮層細胞排列有序，結構完整，組織間隙無增大，錐體細胞核呈藍色清晰可見，細胞膜完整。

2.2 經硬腦膜電刺激致驚厥發(fā)作后額葉皮層NGB免疫組化染色

標本經DAB顯色后，陽性細胞表現為棕黃色的NGB 免疫反應(NGB-immunoreactive，NGB-IR)，背景色淡，神經元胞質中見NGB-IR陽性物質表達，神經突起中也可見少量陽性表達。

假手術組大腦皮質中廣泛分布NGB-IR陽性細胞，其中以額葉、顳葉NGB-IR陽性細胞數量較多，染色較明顯。在海馬各區(qū)域(CA1-4區(qū))中，NGB-IR陽性細胞主要分布于錐體細胞層，其他部分NGB-IR陽性細胞分布較稀少。驚厥發(fā)作組與假手術組相比較，驚厥發(fā)作后5 min大鼠額葉皮層中NGB表達即明顯增高，并呈逐漸升高，30 min組NGB表達最高，持續(xù)驚厥發(fā)作停止后1 h的延時組NGB表達則出現明顯下降(圖2，見第323頁)。各驚厥發(fā)作組與假手術對照組相比較NGB表達差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);驚厥發(fā)作各組間相比較，5 min組與15 min組差異不大(P＞0.05);15 min組與30 min組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組間差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，見表1)。

3 討論

大腦占體重的2%，總耗氧卻占全身耗氧量的25%，因此腦組織作為神經系統(tǒng)和意識中樞，在組織對氧利用的研究上歷來非常被重視。以往人們僅知道Hb和Mb兩種攜氧蛋白能促進氧的利用。在2000年，Burmester等［2］首先發(fā)現并報道了人和小鼠的含有1個血紅素結構和蛋白質肽鏈的一個全新的珠蛋白家族成員，即腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)，他們通過一系列的動物實驗證實，NGB mRNA在腦中高表達，并且其表達程度與相應區(qū)域腦組織缺血缺氧后損傷的程度呈負相關。Sun等［5］觀察了NGB與皮質細胞缺氧之間的關系，發(fā)現隨缺氧時間的增加，NGB表達呈逐漸增高趨勢，認為低氧可以誘導大腦皮質神經元細胞NGB mRNA和蛋白的表達。由此表明NGB可能能夠保護低氧損傷下腦組織。

表1 不同時相大鼠額葉皮層NGB表達情況 (n=5，/HP，±s)Tab 1 NGB expression in rat frontal cortex at different stages(n=5，/HP，±s)

表1 不同時相大鼠額葉皮層NGB表達情況 (n=5，/HP，±s)Tab 1 NGB expression in rat frontal cortex at different stages(n=5，/HP，±s)

與假手術組比較，*P＜0.01;除15 min與15 min比較P＜0.05，5 min與15 min比較P＞0.05，其余各驚厥發(fā)作組間均P＜0.01

組別 n 5 630.350±70.150 5 min組 5 1 187.200±41.518*15 min組 5 1 164.850±63.166*30 min組 5 1 209.800±83.695*30 min延遲組 5 966.950±77.166額葉皮層假手術組*

關于本研究中的模型選擇，在眾多的動物致癇模型中之所以選擇急性電刺激模型，主要有以下考慮:(1)NGB對缺氧反應極其敏感，并有一定的延時效應，Sun等［5］報道，培養(yǎng)的HN33細胞在缺氧24 h后，NGB mRNA及蛋白表達均增高。因此，如果選用慢性模型，隨著發(fā)作次數的延長，間斷缺氧頻次增加，NGB有可能亦隨之表達增加，因此無法判斷NGB表達增加是多次發(fā)作后的累積效應還是最后一次發(fā)作的急性表達，因此選用急性發(fā)作模型較好。(2)急性發(fā)作模型中，藥物致癇模型具有諸多缺點，藥物本身對NGB表達有何種影響尚不明確，藥物是否會增加或減少NGB的表達暫時還沒有相關對照性研究，選用藥物致癇模型后其NGB表達結果的可信度有一定的下降。藥物致癇后的急性模型，其發(fā)作的持續(xù)時間無法精確地人為控制，無法讓每一只已隨機分組的動物根據實驗的需要，持續(xù)發(fā)作相應長的時間。這里有幾種情況:①如果發(fā)作時間過短，沒有達到預定時間即完全停止發(fā)作，則NGB表達不能等同于發(fā)作更長時間的結果;②如果發(fā)作時間過短，但并未完全停止發(fā)作，而是呈現出間斷發(fā)作，則結果與短時發(fā)作及持續(xù)發(fā)作不能等同;③如果發(fā)作時間超過預定時間，那么在預定時間到達后如何將正在繼續(xù)發(fā)作中的動物進行標本取材將是一個非常困難的問題;④如果簡單的將發(fā)作時間相同的動物分組，則失去了保持實驗動物分組最基本的隨機性原則。(3)放棄使用皮層電刺激模型的原因，皮層電刺激需要將電極直接接入動物大腦皮層，電極會對皮層有一定的壓迫作用，在發(fā)作過程中，由于驚厥過程動物會出現強直陣攣，尤其是發(fā)作時間較長時，電極有可能對皮層形成較大的損傷，這種損傷將會導致NGB在皮層的表達迅速增高［6］，從而影響對結果的判別。(4)放棄使用非持續(xù)給電刺激致癇模型的原因，與藥物致癇的急性模型具有同樣的無法控制發(fā)作持續(xù)及終止時間的問題。因此，本實驗選用經硬腦膜電刺激模型，較好地模擬了驚厥時痙攣強直性大發(fā)作狀態(tài)，通過給予電刺激的持續(xù)時間不同，嚴格模擬了不同的驚厥發(fā)作持續(xù)時間，通過較大的刺激強度，保證了發(fā)作的均一性，不存在各種發(fā)作強度形式參雜對NGB表達強度潛在的影響。

本研究運用免疫組織化學的技術，從蛋白質水平初步揭示了大鼠驚厥發(fā)作后，大腦額葉皮層神經元NGB的表達規(guī)律。從本實驗統(tǒng)計分析可以發(fā)現，驚厥發(fā)作后5 min組、15 min組、30 min組的NGB表達隨缺氧耗氧時間增加而呈現出迅速遞增趨勢。其原因可能與心肌細胞及骨骼肌細胞收縮造成短暫缺血類似，在癲癇發(fā)作時神經沖動爆發(fā)，對氧的需求量大大增加［7］。隨著發(fā)作時間持續(xù)延長，局部神經元相對缺氧必然越來越重。作為氧的載體，NGB在缺氧發(fā)生時迅速出現的高表達對局部組織細胞缺氧壓力的緩解和神經元的繼發(fā)損傷具有重要的神經保護作用。劉新建等［8］的研究證實，腦紅蛋白能通過抑制促凋亡蛋白Bax的表達，減少神經細胞的凋亡，發(fā)揮其神經保護作用。驚厥發(fā)作不同時相的各組間相比較，5 min組與15 min組的NGB表達差異不顯著(P＞0.05)，而15 min組與30 min組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，5 min組與30 min組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明NGB隨發(fā)作持續(xù)時間延長而表達增加并非呈線性趨勢，而是呈逐級遞增趨勢。這可能與大腦皮層耐受缺氧的敏感程度有關，因缺血導致大腦皮層損傷達到最大損傷一半的時間是19.1 min，在海馬約為 12.7 min［9］。本實驗中30 min組的驚厥發(fā)作持續(xù)時間剛好超過了上述大腦缺氧耐受的關鍵時間點，因而NGB表達呈現顯著增加。

癲癇持續(xù)狀態(tài)30 min后停止發(fā)作，延遲1 h組的NGB的表達較其他驚厥發(fā)作組NGB表達明顯下降，此種現象的產生可能與隨著停止發(fā)作的時間延長，腦的耗氧量逐漸降低，神經元功能部分恢復正常有關，需氧量的下降使得NGB表達亦隨之減少。章軍焰等［10］證實神經細胞在癲癇發(fā)作前后數量及活力并無顯著性差異，因此，NGB表達于發(fā)作后減少可以排除是由于癲癇導致缺氧時間過長引起神經細胞死亡分解所致。NGB于驚厥持續(xù)發(fā)作狀態(tài)30 min停止后1 h表達仍明顯高于假手術對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明NGB在缺氧后迅速產生，其后的減少過程相對于產生過程則較為緩慢，說明NGB對神經元的保護作用具有持續(xù)性的特點，但具體能夠持續(xù)多長時間有待進一步深入研究。

近年來，已有醫(yī)務工作者在臨床實踐中探索高壓氧治療癲癇并取得較好的治療作用［11，12］，其原理為［13］:高壓氧可提高動脈血氧分壓，有效地提高血液中的氧濃度，進而增加腦組織的含氧量和氧儲備量，促進血氧彌散量和彌散距離，克服了缺氧引起腦水腫時神經細胞與血管間距離增大導致的供氧障礙，促進氧向神經元的擴散，糾正神經元的缺氧狀態(tài)，促進腦組織有氧代謝，解除缺氧狀態(tài)，從而使受損神經元正常的功能得以修復，改善腦細胞的電生理功能，減少異常放電。本研究中，驚厥發(fā)作后NGB表達隨發(fā)作持續(xù)時間延長而呈持續(xù)升高狀態(tài)，NGB通過提高表達能夠將儲備氧緩慢釋放，起到類似于高壓氧能夠增加非血紅蛋白攜氧的作用，進而緩解因癲癇發(fā)作引起的相對缺氧狀態(tài)對神經元的急性損傷。雖然NGB的表達增加并不能直接抑制腦組織的異常興奮點或是阻斷癲癇異常放電的通路，但是NGB作為神經系統(tǒng)特異性氧載體可以通過發(fā)揮內源性神經保護作用，減輕癲癇發(fā)作尤其是癲癇持續(xù)狀態(tài)對腦組織所造成的缺氧性損害。

Ye等［14］研究發(fā)現，在癲癇發(fā)作過程中可直接導致細胞凋亡解體的蛋白酶系統(tǒng)caspase-3在利用siRNA沉默NGB后表達水平顯著增加，提示癲癇發(fā)作時通過增加NGB表達有可能進一步改變caspase-3的表達，進而抑制癲癇發(fā)作過程繼發(fā)性缺氧性損傷導致的神經元凋亡發(fā)生。對于NGB的神經保護機制目前尚未完全明了，其在癲癇發(fā)作中與其他因素的相互作用關系還有待進一步深入研究。

總之，大鼠驚厥發(fā)作后，大腦皮層細胞內的NGB表達呈現出隨驚厥發(fā)作的持續(xù)時間增加而逐級迅速遞增，發(fā)作結束后NGB的表達即隨之下降，但下降速度小于發(fā)作時的上升速度，提示NGB參與了驚厥發(fā)作過程的腦保護過程，且這種保護作用具有一定的持續(xù)性，從新的角度提示了高表達NGB在癲癇發(fā)作時對缺氧性腦損傷具有的保護作用，為癲癇的研究提供一種新的思路。

［1］ Yager JY，Armstrong EA，Miyashita H，et al.Prolonged neonatal seizures exacerbate hypoxic-ischemic brain damage:correlation with cerebral energy metabolism and excitatory amino acid release［J］.Dev Neurosci，2002，24(5):367-381.

［2］ Burmester T，Weich B，Reinhardt S.A vertebrate globin expressed in the brain［J］.Nature，2000，407(6803):520-523.

［3］ Voskuyl RA，Dingemanse J，Danhof M.Determination of the threshold for convulsions by direct cortical stimulation［J］.Epilepsy Res，1989，3(2):120-129.

［4］ Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32:281.

［5］ Sun Y，Jin K，Mao XO，et al.Neuroglobin is upregulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(26):15306-15311.

［6］ 陳雪梅，官鵬，杜顯剛，等.大鼠腦外傷后大腦皮質腦紅蛋白的表達［J］.中國法醫(yī)學雜志，2010，25(5):319-326.

［7］ 萬選才，楊天祝，徐承燾.現代神經生物學［M］.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1999:471.

［8］ 劉新建，劉麗娜，溫慧敏，等.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬區(qū)腦紅蛋白、凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達及其相關性［J］.細胞與分子免疫學雜志，2010，26(10):1040-1042.

［9］ Zivin JA.Factors determining the therapeutic window for stroke［J］.Neurology，1998，50(3):599-603.

［10］ 章軍焰，鄒麗萍，趙蘭峰，等.N-甲基-D-天冬氨酸致癇乳鼠行為學與腦內腦紅蛋白表達的研究［J］.中國實用兒科雜志，2006，21(11):867-868.

［11］ 謝金祥.高壓氧綜合治療癲癇的經驗［J］.中華理療雜志，1999，22(6):338-340.

［12］ 謝金祥，連文洪.國內應用高壓氧治療癲癇的現狀［J］.中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志，2003，10(4):249-251.

［13］ 房廣才.臨床高壓氧醫(yī)學［M］.北京:華文出版社，1995:311-312.

［14］ Ye SQ，Zhou XY，Lai XJ，et al.Silencing neuroglobin enhances neuronal vulnerability to oxidative injury by down-regulating 14-3-3gamma［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(7):913-918.