亞慢性鎘中毒腎功能性損傷小鼠模型的研究

李穎超，武 昕，嚴家榮，鐘志勇，黃 威，唐小江(山西醫科大學公共衛生學院，太原 03000;廣東省醫學實驗動物中心比較醫學實驗室;通訊作者，E-mail:river-t@6.com)

鎘(cadmium，Cd)是一種對人體危害極大的重金屬，能通過多種途徑進入機體，不易排出，半衰期長達數十年，對肝臟、腎臟、骨骼、生殖系統等造成嚴重損害［1］。1993年，國際癌癥研究中心(IARC)將鎘確定為ⅠA級致癌物，即人類的致癌毒物［2］。但目前尚沒有針對鎘中毒的特效藥。2006年，唐小江博士發明了一種具有自主知識產權的新型絡合物—N-(2，3，4，5，6－五羥基己基)－(N －二取代甲酸鈉基)－L－甲硫氨酸鈉［3］，前期實驗表明，該絡合物具有良好的驅鎘效果［4］。腎臟作為鎘發揮毒作用的重要靶器官之一，在慢性鎘中毒早期即可出現功能性損傷，但關于腎臟功能性損傷的動物模型報道較少，本研究擬建立亞慢性鎘中毒腎功能性損傷但無明顯器質性損傷的小鼠模型，再使用該絡合物進行驅鎘治療，以模擬人類在接觸鎘早期出現腎功能改變時即進行驅鎘治療，進一步評價其驅鎘治療效果。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，分析純，天津市福晨化學試劑廠;鹽酸、硝酸、高氯酸、過氧化氫溶液，均為優級純，購自廣州化學試劑廠;巰基乙醇(ME)，美國Sigma公司;尿β2微球蛋白ELISA試劑盒和尿視黃醇結合蛋白ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司;肌酐測定試劑盒(堿性苦味酸法)購自南京建成生物工程研究所;基體改進劑(0.02%氯化鈀 +0.1%硝酸+0.01%TritonX －100)。

原子吸收分光光度計(900T，Perkin Elmer公司);熒光顯微鏡(BX41，Olympus公司);全波長酶標儀(Multiskan Go，Thermfisher公司)。

1.2 實驗動物及飼養環境

SPF級NIH小鼠，雄性，26只，體重18－22 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供［實驗動物生產許可證號:SYXK(粵)2008－0002］。動物飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級動物房［實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2008－0002］，動物房溫度為20－26℃，相對濕度在40% －70%。自由進食和飲水，顆粒飼料和飲用水均由廣東省醫學實驗動物中心提供，本實驗經廣東省醫學實驗動物中心動物倫理委員會審批批準。

1.3 染毒藥物的配制

按照表1所述進行各濃度染毒藥物的配制，配制完成后，使用0.22 μm微孔濾膜過濾滅菌，然后在4℃條件下保存，使用時取出待藥物恢復至室溫時再進行腹腔注射。

表1 亞慢性鎘中毒腎功能性損傷實驗染毒藥物配制Tab 1 Preparation methods of the solutions for injection in experiment on subchronic kidney function damage induced by cadmium

1.4 分組及染毒

動物檢疫合格后，選取體重最接近的24只動物，按體重隨機分為4組，每組6只，分別為正常對照組，低、中、高劑量組。高、中、低劑量組動物分別腹腔注射表1中序號2－4中的CdCl2和ME混合溶液，注射劑量為 10 ml/kg，1 次/d，連續5 d，總染鎘劑量分別為3.37，1.69，0.84 mg Cd/kg，對照組注射生理鹽水，末次染毒后各組動物觀察35 d。

1.5 樣本收集及檢測

觀察結束后，代謝籠加冰盒收集小鼠禁食、不禁水情況下12 h尿液，按試劑盒說明測定尿中的β2－微球蛋白(UBMG)、視黃醇結合蛋白(URBP)、肌酐(Cr)含量。然后斷頭取血0.6 ml，肝素抗凝，用于測定鎘含量。解剖小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸等臟器，稱重后計算臟器系數。左腎、左側睪丸用4%甲醛溶液固定用于病理檢查，右腎用于測定鎘含量。臟器系數=臟器質量/體重×100%。

血液用基體改進劑稀釋10倍，右腎消化后，采用原子吸收光譜儀測定鎘含量，測定波長228.8 nm;狹縫寬度0.70 nm;燈電流4.0 mA。積分模式:峰面積;背景校正:塞曼校正法。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 一般情況

各組動物在整個實驗過程中與正常對照組表現基本相同，未出現死亡及其他異常情況。實驗結束后，各實驗組動物的體重與正常對照組相比，差異無統計學意義(P ＞0.05，見表2)。

表2 實驗各組動物的體重比較(±s，n=6)Tab 2 Comparison of body weight among four groups(±s，n=6)

表2 實驗各組動物的體重比較(±s，n=6)Tab 2 Comparison of body weight among four groups(±s，n=6)

與正常對照組相比，*P＜0.05

組別 總染鎘劑量(mg Cd/kg) 體質量/g正常對照組46.7 ±2.5低劑量組 0.84 46.4 ±4.3中劑量組 1.69 46.7 ±3.1高劑量組0 3.37 46.1 ±2.8

2.2 尿小分子蛋白測定結果

高劑量組動物的UBMG與正常對照組相比顯著升高(P＜0.05)，低、中劑量組與正常對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。三個劑量組動物的URBP與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05，見表3)。

2.3 血鎘和腎鎘含量測定結果

低、中、高劑量組動物的血鎘和腎鎘含量均顯著高于正常對照組，差異有統計學意義(P＜0.05，見表4)。

表3 各組動物的尿β2－微球蛋白、尿視黃醇結合蛋白測定結果(±s，n=6)Tab 3 Comparison of UBMG and URBP among four groups(±s，n=6)

表3 各組動物的尿β2－微球蛋白、尿視黃醇結合蛋白測定結果(±s，n=6)Tab 3 Comparison of UBMG and URBP among four groups(±s，n=6)

與正常對照組相比，*P＜0.05

組別 總染鎘劑量/(mg/kg) 尿視黃醇結合蛋白/(ng/mg Cr)β2－微球蛋白/(ng/mg Cr)14.80 ±0.380 18.021 ±10.382低劑量組 0.84 11.17 ±0.131 18.393 ±13.404中劑量組 1.69 12.09 ±0.280 22.812 ±11.278高劑量組 3.37 12.20 ±0.292 108.520 ±24.690正常對照0*

表4 各組實驗動物的血鎘、腎鎘含量測定結果(±s，n=6)Tab 4 Comparison of blood cadmium and renal cadmium among four groups(±s，n=6)

表4 各組實驗動物的血鎘、腎鎘含量測定結果(±s，n=6)Tab 4 Comparison of blood cadmium and renal cadmium among four groups(±s，n=6)

與正常對照組相比，*P＜0.05

組別 總染鎘劑量(mg/kg) 血鎘/(μg/L) 腎鎘/(μg/g)0.39 ±0.23 0低劑量組 0.84 15.20 ±3.60* 5.33 ±0.55*中劑量組 1.69 20.12 ±5.35* 10.03 ±1.00*高劑量組 3.37 43.42 ±6.69* 23.25 ±4.98正常對照組0*

2.4 臟器觀察結果

各組動物的臟器系數見表5。低劑量組動物心臟的臟器系數與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，但，中、高劑量組與對照組相比無明顯變化(P＞0.05)。中、高劑量組動物的脾臟臟器系數與對照組相比顯著升高(P＜0.05)，各劑量組的其他臟器的臟器系數與對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。各組動物的左腎、左側睪丸病理檢查均未發現明顯病理變化，見圖1，2。

圖1 染鎘小鼠左腎組織病理觀察 (HE，×200)Fig 1 Pathological changes of left kidney in mice after exposure to cadmium (HE，×200)

圖2 染鎘小鼠左側睪丸組織病理觀察 (HE，×200)Fig 2 Pathological changes of left testicle in mice after exposure to cadmium (HE，×200)

表5 各組動物臟器系數的比較(±s，%，n=6)Tab 5 Comparison of relative organ parameters among four groups(±s，%，n=6)

表5 各組動物臟器系數的比較(±s，%，n=6)Tab 5 Comparison of relative organ parameters among four groups(±s，%，n=6)

組別 總染鎘劑量(mg/kg)睪丸 腎正常對照組 0 0.361 ±0.039 4.289 ±0.368 0.231 ±0.066 0.381心肝脾肺腦±0.072 0.863 ±0.045 0.423 ±0.078 1.003 ±0.077低劑量組 0.84 0.446 ±0.069* 4.146 ±0.208 0.258 ±0.052 0.408 ±0.107 0.868 ±0.127 0.434 ±0.062 1.210 ±0.107中劑量組 1.69 0.414 ±0.033 4.349 ±0.216 0.472 ±0.098* 0.499 ±0.073 0.922 ±0.086 0.426 ±0.049 1.140 ±0.105高劑量組 3.37 0.389 ±0.047 4.251 ±0.308 0.440 ±0.161* 0.497 ±0.076 0.943 ±0.074 0.433 ±0.076 1.095 ±0.178

3 討論

腎臟是鎘發揮毒作用的主要靶器官之一。國內外許多學者對鎘的腎臟毒性進行了研究［5－9］。有研究表明，與單次染毒相比，對動物進行多次鎘染毒更接近于人體長期接觸鎘的情況［10］，但目前對于鎘中毒的腎損傷研究多在于關注鎘染毒后對于機體器官系統造成的損傷狀況［11，12］。鎘對腎臟造成的器質性損傷是較難用藥物逆轉的，因此，采用腎臟器質性損傷動物模型來研究驅鎘藥物容易出現假陰性的結果。本研究為深入研究新型驅鎘絡合物的驅鎘作用機制，采用NIH小鼠制備腎臟功能性損傷模型，結果發現，小鼠染鎘后，腎鎘和血鎘含量與對照組相比均顯著性升高(P＜0.05)，且未見腎臟的病理改變。

研究中選取的尿β2－微球蛋白和視黃醇結合蛋白均為反映腎小管功能損傷情況的指標［13，14］。我國最新頒布《職業性鎘中毒診斷標準》(GBZ 17－2002)中也采用尿β2－微球蛋白和視黃醇結合蛋白作為慢性鎘中毒的尿蛋白檢測指標。本研究發現，高劑量組動物的尿β2－微球蛋白含量顯著高于對照組，說明高劑量組動物的腎小管的重吸收功能受到了破壞，但尿視黃醇結合蛋白含量未見顯著性差異。推測視黃醇結合蛋白在反映鎘中毒程度的情況時敏感性可能不如尿β2－微球蛋白。袁華敏等的研究表明，尿β2－微球蛋白和視黃醇結合蛋白對鎘等重金屬超標的診斷功能的是相互獨立的，二者不具有絕對的相關性［15］。黃波等曾報道，當人體鎘攝入量達50 mg以上時，尿β2－微球蛋白即出現顯著升高，而尿視黃醇結合蛋白在鎘攝入量達200 mg以上時才出現明顯改變［16］。本實驗驗證了文獻報道的實驗結果。

實驗中對小鼠染毒時使用的巰基乙醇含有巰基，可與鎘離子結合，在體內加快鎘向腎臟的轉移，在一定程度上能縮短造模時間［17］。鎘是一種低溫元素，而血樣基體復雜，在用原子吸收光譜儀測定血鎘時，樣品的灰化過程中鎘易蒸發損失，且易受到基體的干擾，加入基體改進劑可減少灰化過程中鎘的損失，減少背景吸收，增加測定的準確性［18］。

綜合本次研究的結果，認為按6.78 mg Cd/kg的劑量對小鼠腹腔注射，1次/d，連續5 d，末次染毒后觀察35 d可建立小鼠亞慢性鎘中毒腎功能損傷模型，可用于驅鎘藥物的篩選和作用機制的研究。有關鎘離子如何進入組織細胞以及驅鎘藥物如何在體內、體外起到驅鎘作用及其作用機制，有待深入研究。

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