瑞舒伐他汀對兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD147的表達(dá)及斑塊穩(wěn)定性的影響

薛 峰，杜大勇，李運(yùn)田，李雪杰，賴曉輝，柳 楊，王新亮，李沫言(南方醫(yī)科大學(xué)心內(nèi)科，廣州5055;解放軍第305醫(yī)院心臟疾病診療中心;通訊作者，E-mail:lyt305@6.com)

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂繼發(fā)血栓形成是急性心腦血管事件的根本發(fā)病機(jī)制。斑塊的纖維帽厚度、膠原組織的含量、炎癥細(xì)胞聚集和炎癥反應(yīng)程度等因素決定著斑塊穩(wěn)定性。目前認(rèn)為，由于斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞過度表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶過度分解斑塊內(nèi)基質(zhì)膠原蛋白，纖維帽變薄，斑塊出現(xiàn)不穩(wěn)定破裂［1］。因此基質(zhì)金屬蛋白酶的過度表達(dá)活化是斑塊不穩(wěn)定的重要機(jī)制。

CD147分子(細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，extracellularmatrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)作為金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的誘導(dǎo)因子，其通過誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶的分泌活化，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。瑞舒伐他汀作為目前一種新型降脂藥物，除了具有降脂作用外，還可通過抑制斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定斑塊的作用。但瑞舒伐他汀能否抑制CD147的表達(dá)來起到穩(wěn)定斑塊的作用尚不清楚。本研究通過建立兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，探討血清炎癥因子濃度水平變化、斑塊內(nèi)CD147的表達(dá)水平與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系，并探索瑞舒伐他汀穩(wěn)定斑塊的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

健康純種雄性新西蘭白兔18只，月齡3個(gè)月左右，體重(2.5±0.1)kg，購于北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(京)2007-0003。高脂飼料(1%膽固醇、3%大油、15%蛋黃、81%普通飼料)購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司［許可證號(hào):SCXK(京)2005-0007］。瑞舒伐他汀由美國阿斯利康公司提供，MMP-2、MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購于上海藍(lán)基生物科技有限公司;CD147單克隆抗體購于美國Abcam公司;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;Trizol(美國Invitrogen公司);堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購于美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將動(dòng)物采用抽簽法隨機(jī)分為3組，分別為:A組為空白對照組:普通飼料喂養(yǎng);B組為模型組:造模+高脂飼料喂養(yǎng);C組為藥物干預(yù)組:造模+高脂飼料+瑞舒伐他汀鈣片(每天2.5 mg/kg)。

1.3 動(dòng)物模型的建立

按普通級(jí)動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由飲水。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，對B組及C組動(dòng)物實(shí)施右側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜液氮凍傷術(shù)［2］。第1次術(shù)后B組和C組動(dòng)物高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)13周，隨即進(jìn)行第2次頸動(dòng)脈液氮激發(fā)術(shù)。第2次術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)1周后戊巴比妥鈉處死。A組一直給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.4 給藥方法

C組第1次術(shù)后第1天，開始灌胃給藥。自制開口器撐開兔口，插入小兒胃管，證實(shí)進(jìn)入胃內(nèi)后，每只兔按2.5 mg/kg計(jì)算給藥，稀釋于10 ml生理鹽水灌胃，每日一次。A組和B組給予同等劑量的生理鹽水。

1.5 血清MMP-2、MMP-9的檢測

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)及15周末分別在空腹條件下經(jīng)兔耳緣靜脈取血，離心分離血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(購于上海藍(lán)基生物科技有限公司)測定MMP-2、MMP-9的水平，嚴(yán)格按照試劑盒和酶標(biāo)儀說明書步驟進(jìn)行操作。

1.6 組織形態(tài)學(xué)檢查

三組兔于15周末全部處死，取右側(cè)頸總動(dòng)脈血管，以10%中性福爾馬林溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，血管橫截面作4 μm連續(xù)切片，行HE染色觀察兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊情況。

1.7 RT-PCR 檢測

取100 mg頸動(dòng)脈血管置于裝有液氮的研缽中，將組織研磨成粉末，加入1 ml Trizol充分混勻并移入EP管中，其余操作參照試劑盒說明書。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR):RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA，PCR反應(yīng)引物序列參照表1，冰浴條件下操作，徹底混合后ABI Prism 7900HT型熒光定量PCR儀。反應(yīng)程序如下:50℃ 2 min→95℃ 15 s、60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)→95℃ 15 s、60℃ 15 s、95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，以目的基因與GAPDH拷貝數(shù)比值進(jìn)行相對定量分析。

表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)引物及產(chǎn)物Tab 1 Primers for RT-PCR and its products

1.8 蛋白質(zhì)印跡測定

取0.1 g兔頸動(dòng)脈血管組織，加入液氮研磨后置于勻漿器中，加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液勻漿。4℃靜置2 h，12 000×g離心40 min，取上清。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取40 μg總蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，膜經(jīng)小牛血清(BSA封閉2 h)后，加入一抗(1∶400)4℃孵育過夜。TBS洗膜后，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，用堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。以GAPDH做為內(nèi)參。用Bandscan5.0軟件測定蛋白條帶灰度值，以目的條帶與相應(yīng)的GAPDH灰度比值做為樣本表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況

所有18只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部完成實(shí)驗(yàn)，其中B組2只兔子第2次液氮激發(fā)術(shù)后(14周末)出現(xiàn)腦梗死。所得18只動(dòng)物數(shù)據(jù)參與分析。A組6只，B組6只，C組6只。

2.2 血清MMP-2、MMP-9水平的變化

根據(jù)表1結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)前，各組兔血清MMP-2、MMP-9水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。第15周末，空白對照組MMP-2、MMP-9水平與同組實(shí)驗(yàn)前相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);模型組和藥物干預(yù)組MMP-2、MMP-9與同組實(shí)驗(yàn)前相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第15周末藥物干預(yù)組MMP-2、MMP-9 水平明顯低于模型組(P ＜0.05)。

表2 各組MMP-2、MMP-9水平變化比較(ng/ml，±s)Tab 2 MMP-2 and MMP-9 levels in three group(ng/ml，±s)

表2 各組MMP-2、MMP-9水平變化比較(ng/ml，±s)Tab 2 MMP-2 and MMP-9 levels in three group(ng/ml，±s)

同組與0周時(shí)比較，△P＜0.05;與空白對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

組別MMP-2 0周 15周MMP-9 0周 15周0.33 ±0.04 0.32 ±0.08 0.76 ±0.09 0.85 ±0.14模型組 0.31±0.04 1.86±0.10△＊ 0.74±0.08 10.54 ±0.83△＊藥物干預(yù)組 0.30 ±0.03 1.23 ±0.10△＊# 0.72 ±0.11 7.05 ±1.43△＊#空白對照組

2.3 病理學(xué)觀察

空白對照組兔頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，排列整齊，內(nèi)彈力膜清晰完好，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，未見明顯斑塊形成;模型組兔右側(cè)頸總動(dòng)脈可見典型的不穩(wěn)定斑塊，斑塊表現(xiàn)為薄的纖維帽，較大的脂質(zhì)核心以及大量炎癥細(xì)胞浸潤;藥物干預(yù)組兔右側(cè)頸總動(dòng)脈可見典型的穩(wěn)定斑塊(見圖1)。斑塊表現(xiàn)為較厚的纖維帽，脂質(zhì)核心較小。

圖1 各組頸動(dòng)脈病理組織HE染色結(jié)果 (HE染色，×100)Fig 1 The pathological results of carotid artery in 3 groups (HE，×100)

2.4 RT-PCR 結(jié)果

三組間CD147 mRNA表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為模型組CD147 mRNA表達(dá)量最高，空白對照組CD147 mRNA表達(dá)量最低，而藥物干預(yù)組CD147 mRNA表達(dá)量介于上述兩組之間。模型組與空白對照組相比，CD147 mRNA表達(dá)量升高19.5倍。藥物干預(yù)組與模型組相比，CD147 mRNA表達(dá)量降低45.3%，見表3。

2.5 Western blot結(jié)果

CD147蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白表達(dá)條帶相對吸光度值見表3，圖2。各組間CD147蛋白含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，表現(xiàn)為空白對照組頸動(dòng)脈局部CD147蛋白含量最低，模型組CD147蛋白含量最高，而藥物干預(yù)組CD147蛋白含量介于上述兩組之間。模型組與空白對照組相比，CD147蛋白表達(dá)量升高1.37倍。藥物干預(yù)組與模型對照組相比，CD147蛋白表達(dá)量降低17.5%。

表3 各組CD147 mRNA及CD147蛋白表達(dá)情況(±s)Tab 3 Expression of CD147 mRNA and CD147 protein in 3 groups(±s)

表3 各組CD147 mRNA及CD147蛋白表達(dá)情況(±s)Tab 3 Expression of CD147 mRNA and CD147 protein in 3 groups(±s)

與空白對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

組別 CD147 mRNA(Qty) CD147(A值)0.006 ±0.003 0.292 ±0.020模型組 0.117 ±0.013* 0.401 ±0.038*藥物干預(yù)組 0.064 ±0.012*# 0.331 ±0.016*#空白對照組

圖2 各組兔頸動(dòng)脈CD147蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 2 Western blot results of expression of CD147 protein in 3 group

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是動(dòng)脈管壁長期慢性進(jìn)展性炎癥性病變，其特征由富含脂質(zhì)的粥樣核心內(nèi)有炎癥細(xì)胞聚集以及其表面覆蓋的纖維帽構(gòu)成。從病理學(xué)上觀察斑塊穩(wěn)定與否與纖維帽的厚度、炎癥細(xì)胞的聚集程度及膠原組織的含量多少密切相關(guān)［3］。而目前的研究證實(shí)，斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度是導(dǎo)致纖維帽變薄、斑塊不穩(wěn)定的最為重要的因素。由于炎癥介質(zhì)刺激斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞活化，后者表達(dá)和分泌大量MMPs，導(dǎo)致斑塊內(nèi)包括膠原在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)降解，纖維帽變薄，使斑塊不穩(wěn)定，易于破裂，從而產(chǎn)生急性心腦血管事件［4，5］。Kai等［6］發(fā)現(xiàn)外周靜脈血中MMP-2和MMP-9的水平與急性心腦血管事件有關(guān)。本研究中，模型組血清MMP-2、MMP-9濃度較藥物干預(yù)組明顯升高。病理結(jié)果顯示模型組頸動(dòng)脈內(nèi)斑塊形態(tài)為脂核大，炎癥細(xì)胞多，纖維帽薄，6例中4例出現(xiàn)斑塊破裂和血栓形成，符合病理學(xué)中不穩(wěn)定斑塊的特點(diǎn);而藥物干預(yù)組斑塊脂核小，炎癥細(xì)胞少，纖維帽厚，為穩(wěn)定斑塊。因而認(rèn)為血清MMP-2、MMP-9的濃度水平與斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，可以作為臨床上反映體內(nèi)斑塊穩(wěn)定性的血清學(xué)指標(biāo)。

CD147分子是一種高度糖基化的、廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，最初是從肺癌細(xì)胞系LX-1中分離出來。CD147分子是基質(zhì)金屬蛋白酶的上游調(diào)控因子，它能夠以旁分泌的方式在多種細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)過度產(chǎn)生MMPs，降解細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和免疫性疾病的炎癥活動(dòng)［7］。而CD147與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)MMP表達(dá)以及斑塊穩(wěn)定性之間機(jī)制尚不清楚。Schmidt等［8］研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者體內(nèi)的單核細(xì)胞表面CD147的表達(dá)量明顯高于穩(wěn)定性心絞痛患者。目前國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［9，10］，CD147表達(dá)減少能抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)MMP-9，降低其遷移能力。本研究中，模型組斑塊局部CD147 mRNA及CD147蛋白表達(dá)量明顯高于藥物干預(yù)組和空白對照組，同時(shí)外周血清中MMP-2、MMP-9濃度水平模型組也高于藥物干預(yù)組和空白對照組。研究顯示，CD147高表達(dá)，促進(jìn)MMPs過度產(chǎn)生，加劇斑塊內(nèi)基質(zhì)降解，使纖維帽變薄，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，因此認(rèn)為CD147在MMPs產(chǎn)生過程中起至關(guān)重要的作用，可能對斑塊穩(wěn)定性產(chǎn)生關(guān)鍵性影響。

瑞舒伐他汀作為一種新型的降脂藥物在臨床上廣泛應(yīng)用，其除了具有強(qiáng)大的降脂作用外，還可在抑制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊等方面發(fā)揮重要作用［11，12］。本研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀干預(yù)組血清MMP-2、MMP-9濃度水平以及斑塊局部CD147的表達(dá)水平較模型組明顯降低，斑塊穩(wěn)定性較模型對照組明顯升高，表明其通過抑制CD147表達(dá)、降低MMP-2、MMP-9水平達(dá)到穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。

本研究通過觀察兔頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型中血清MMP-2、MMP-9濃度水平變化及斑塊內(nèi)CD147的表達(dá)情況與斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系，以及瑞舒伐他汀干預(yù)對血清MMP-2、MMP-9濃度水平變化以及斑塊內(nèi)CD147表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈易損斑塊局部CD147的表達(dá)以及血清MMP-2、MMP-9的濃度水平明顯增加。而瑞舒伐他汀可以明顯抑制斑塊局部CD147的表達(dá)及降低血清中MMP-2、MMP-9濃度水平。因此，瑞舒伐他汀可能通過抑制CD147表達(dá)及降低血清MMP-2、MMP-9等炎癥因子水平，從而發(fā)揮其穩(wěn)定斑塊的作用。而瑞舒伐他汀通過降脂、抑制炎癥反應(yīng)或其他調(diào)節(jié)CD147的表達(dá)機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

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