蛻皮甾酮對大鼠蛛網膜下隙出血后大腦皮質損傷的影響

徐 麗，金清東，朱志紅，張 敏，楊海東(福建省莆田學院醫學院生理教研室，莆田 3500;福建省莆田市第一醫院神經外科;通訊作者，E-mail:jqd007@6.com)

蛛網膜下隙出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種常見的神經系統急危重癥，年發病率為5－20/10萬，近30年來發病率呈上升趨勢［1］，給家庭、社會帶來沉重負擔［2，3］，探討 SAH 后腦損傷機制及有效的藥物治療成為急需解決的問題。蛻皮甾酮(ecdysterone，EDS)是一種天然甾體化合物，是中藥牛膝、祁州漏蘆等的活性成分［4］。具有改善微循環、改善血液流變學、抗氧化及細胞保護、降低毛細血管通透性、增強機體免疫功能和調節血管舒縮等多種功效［5－7］。

本實驗建立非開顱大鼠SAH模型，應用蛻皮甾酮干預，通過檢測腦含水量、免疫組化檢測Bcl-2，Caspase-3，TUNEL檢測神經細胞凋亡探討蛻皮甾酮在蛛網膜下隙出血后腦損傷治療中的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

手術顯微鏡(MS-2)購自德國Leica公司，顯微照相系統購自日本OLYMPUS公司，蛻皮甾酮購自中國科學院昆明植物研究所，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒、Bcl-2抗體、Caspase-3抗體及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠60只，體重300－350 g，隨機分為3組，每組20只:假手術組，除不刺破動脈外其余操作與建立SAH模型步驟一致;SAH組，刺破頸內動脈分叉部建立SAH模型［8］;EDS干預組，制備SAH模型同時給予腹腔內注射EDS液20 mg/kg，12 h后再次給藥一次。

1.3 腦含水量測定

實驗后24 h將各組10只大鼠斷頭處死，迅速取腦，濾紙吸去表面血液和水分，取左側大腦皮層腦組織一塊，分析天平稱濕重后置試管內，放入80℃恒溫干燥箱內，烘烤至恒重(二次重量差≤0.2 mg)，取出稱干重。Elliott公式計算腦組織含水量(%)。腦含水量=(濕重－干重)/濕重×100%［9］。

1.4 病理學標本制作與觀察

術后24 h將各組10只大鼠麻醉，迅速開胸暴露心臟，經左心室快速灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，斷頭取腦。取下的腦組織標本置于4%多聚甲醛中固定6 h再依次放入20%，30%的蔗糖溶液中，待腦組織下沉后石蠟切片行 HE染色，光學顯微鏡下觀察并拍片。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡率

石蠟切片常規脫蠟至水，3%H2O2甲醇阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS漂洗，按每張切片取末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxnucleotidyl transferase，TDT)和地高辛標記的dUTP(DIG-dUPT)各1 μl，加入18 μl標記緩沖液中，混勻。吸棄切片上多余液體后加標記液20 μl/片，樣本置于溫盒中，37℃標記2 h。PBS液漂洗，加封閉液，室溫封閉30 min，生物素化抗地高辛抗體滴加標本片，置于溫盒中37℃過夜;PBS液漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。陰性對照 TUNEL反應液中不加TdT，其余反應同前。隨機選取大腦皮質中4個非重疊400倍視野，計數凋亡神經細胞數和神經細胞總數，細胞凋亡率 =凋亡細胞數/細胞總數×100% 。

1.6 免疫組化檢測Bcl-2、Caspase-3表達變化

石蠟切片常規脫蠟至水，嚴格按照ABC試劑盒說明書，抗原修復，山羊血清封閉，滴加1∶200的一抗稀釋液，4℃冰箱中孵育過夜;PBS漂洗3次，滴加1∶100生物素標記二抗，孵育1 h，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，陽性對照片購自北京中杉金橋生物工程有限公司。Bcl-2，Caspase-3蛋白灰度值分析方法:免疫組織化學染色切片參照文獻辨認皮層。以陽性對照片為參照。陽性神經元細胞胞質中可見棕黃色顆粒，否則為陰性。采用美國SimpPCI圖像處理與分析系統進行灰度值分析，測定陽性染色細胞的灰度值，各實驗組取相對應切面觀察，在每張切片取4個非重疊400倍視野，每個視野測量的像素量保持一致，分別測其平均密度值，以上測量值減去相應背景測量值后的平均值為最終灰度值。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 腦含水量測定結果

假手術組皮層含水量為(78.37±0.53)%;與假手術組比較，SAH組腦含水量明顯增加，皮層含水量(80.37±0.58)%，差異有統計學意義(P＜0.05);EDS 治療組腦含水量(79.09 ±1.06)%，與假手術組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與SAH組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 HE染色觀察結果

HE染色后在普通光鏡下觀察可見假手術組大腦皮質神經細胞邊緣清晰，無水腫變性，胞核呈圓形或橢圓形，染色質在核內分布均勻，核仁清晰;SAH組皮質神經細胞邊緣欠清楚，細胞水腫變性，細胞體積增大，胞質稀疏淡染，部分細胞核固縮，核周間隙增寬，部分神經細胞染色不均、核深染、凝集;EDS干預組上述病理變化均有改善(圖1，見第324頁)。

2.3 TUNEL檢測細胞凋亡

假手術組TUNEL染色后可見皮層神經細胞著色淺，基本為透明樣，偶見棕褐色、縮小成不同形狀的細胞，零散可見染色質核膜下聚集成新月形、分葉狀改變，凋亡小體少見(圖2，見第324頁)，神經細胞凋亡率為(4.1±0.58)%;SAH組見部分神經細胞明顯縮小，形狀各異，著色深，胞核內可見深染的棕褐色顆粒，部分細胞可見染色質核膜下聚集成新月形、分葉狀改變，部分細胞可見凋亡小體，核固縮、深染(圖2，見第324 頁)，凋亡率為(26.5 ±3.64)%，與假手術組比較有統計學意義(P＜0.01);EDS干預組神經細胞凋亡較SAH組減少，小部分神經細胞核邊聚、固縮或染色不均或呈分葉狀改變，凋亡小體較少(圖2，見第324頁)，凋亡率為(7.8±1.32)%，與假手術組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與SAH組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.4 Bcl-2、Caspase-3 表達變化

大腦皮質神經細胞可見Bcl-2表達，部分細胞胞質內可見棕黃色顆粒的陽性細胞，量多，SAH組表達減少，差異有統計學意義(P＜0.01)，EDS組表達較SAH組多，但少于假手術組，差異有統計學意義(P＜0.05)。Caspase-3在假手術組少量表達，SAH組明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.01)，EDS組表達顯著低于SAH組，差異有統計學意義(P ＜0.05，見表1，圖3，見第324 頁)。

圖1 各實驗組大鼠皮層腦組織HE染色 (×400)Fig 1 HE staining of rat brain cortex tissues (×400)

圖2 各實驗組大鼠皮層腦組織TUNEL染色 (×400)Fig 2 TUNEL staining of rat brain cortex tissues (×400)

圖3 各實驗組大鼠皮層腦組織Bcl-2，Caspase-3免疫組化染色 (×400)Fig 3 Expression of Bcl-2，Caspase-3 in rat brain cortex tissues by immunohistochemical staining (×400)

表1 各實驗組大腦皮層Bcl-2、Caspase-3灰度值Tab 1 Grey value of Bcl-2 and Caspase-3 expression in rat brain cortex

3 討論

蛛網膜下隙出血是一種常見的神經系統危急重癥，但其具體機制尚不明確，預防和治療效果也不理想。蛻皮甾酮(ecdysterone，EDS)是天然甾體化合物，吳旭等在大鼠肺水腫實驗中發現EDS具有改善肺通透性、減輕脂質過氧化反應、減輕肺水腫的作用;在大鼠急性腦損傷模型中應用EDS干預發現，EDS能通過減輕脂質過氧化反應減輕腦水腫，改善腦缺血［10］。

以往研究發現在蛛網膜下隙出血后2 h即有腦水腫的發生［11］，本研究結果顯示大鼠SAH后24 h腦含水量明顯增加，應用EDS干預后大鼠腦含水量明顯減輕，與吳旭等應用EDS在大鼠急性腦損傷的模型中對抗急性腦水腫結果一致，這說明蛻皮甾酮能減輕SAH引起的腦水腫。

凋亡是神經細胞死亡的重要形式［12］。本研究結果顯示SAH可導致大腦皮質凋亡神經元數量明顯增多，應用EDS干預可明顯減輕神經元凋亡，說明神經細胞凋亡是SAH后早期腦損傷的一種重要機制，而EDS可通過抑制神經元凋亡而起到神經保護作用。調控凋亡的相關基因通常分為兩大類，抗凋亡基因與促凋亡基因。Bcl-2家族為目前發現的最重要的抗凋亡基因蛋白，Bcl-2是一個含有239個氨基酸殘基的蛋白質，能穩定線粒體外膜，是目前已知的主要抗凋亡基因，其抗凋亡主要是通過防止線粒體細胞色素C的釋放，阻斷Caspase的活性和調節鈣通道等抑制細胞死亡。Caspase為一種促凋亡基因蛋白，在細胞凋亡的蛋白酶級聯切割反應的進程中處于核心位置［13］，活化的Caspase-3通過降解細胞骨架、蛋白激酶、轉錄因子等各種底物最終引起細胞凋亡。本研究發現假手術組Bcl-2蛋白表達明顯，SAH組表達最少，而Caspase-3在假手術組中僅少量表達，SAH后明顯增加，應用EDS干預大鼠皮層神經細胞Bcl-2蛋白表達增加，Caspase-3表達減少，說明 EDS可能通過促進 Bcl-2表達，抑制Caspase-3表達從而抑制神經細胞凋亡，減輕SAH后大腦皮質損傷。

總之，蛻皮甾酮作為中藥的主要活性成分，具有多靶點的作用特點，能減輕SAH后早期腦水腫、并通過拮抗神經細胞凋亡保護SAH后大腦皮質損傷，在蛛網膜下隙出血后腦損傷治療中有良好的應用前景。但單一的蛻皮甾酮不能完全阻斷其損傷過程，對SAH后的早期損傷機制應進一步深入研究，臨床上對早期蛛網膜下隙出血的患者應采取綜合的治療措施，才有可能得到最滿意的治療效果。

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