不同劑量氟中毒大鼠拔除左側上頜磨牙后剩余牙槽骨中OPG/OPGL的表達

劉艷春，陳 誠，逯 宜，李曉紅(中鐵二十局中心醫院口腔科，咸陽 7000;西安交通大學口腔醫院修復科;西安交通大學口腔醫院種植中心;共同第一作者，E-mail:cc700_ren@6.com)

破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成作用的動態平衡是維持骨骼完整性必須具備的條件。許多激素以及生長因子、細胞因子參與這個平衡的調控，其單獨或者共同作用于成骨細胞和破骨細胞，均衡兩類細胞的活性，保持骨量的平衡。氟中毒在骨骼中的沉積破壞了這種平衡，影響了骨組織的礦化過程［1］。骨保護素蛋白(osteoprotegerin，OPG)為腫瘤壞死因子受體家族成員，是骨保護素配體(osteoprotegerin ligand，OPGL)的誘騙受體，是影響骨轉換的重要的細胞因子，具有抑制破骨細胞分化和活性的生理功能［2-4］。本實驗通過檢測氟中毒大鼠剩余牙槽骨的OPG及OPGL含量，觀察氟中毒對大鼠剩余牙槽骨骨改建的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

實驗用兔抗大鼠一抗OPG/OPGL為西安交通大學骨病研究所提供，購自博士德生物工程有限公司。

1.2 動物模型建立

45日齡SPF級雄性大鼠60只(西安交通大學醫學院實驗動物中心提供)，體重在150 g左右，隨機分為四組:對照組、低劑量氟中毒組、中劑量氟中毒組和高劑量氟中毒組，每組15只，分別給予蒸餾水、50 mg/L F-溶液、100 mg/L F-溶液和 200 mg/L F-溶液［3］飲用。食物采用常規鼠糧(氟含量小于3 mg/kg)，所有動物于同等條件下分籠飼養，自由進食，記錄每組飲用氟水及蒸餾水的量［5］。6周后，每組隨機抽取5只大鼠，全麻，腹主動脈采血，取左側股骨，固定保存，采用全自動生化分析儀測定血清ALP及標準加入法測定骨氟含量，各組大鼠氟中毒模型建立成功后，全麻下拔除全部左側上頜磨牙，術后給予蔗糖水，1 d后恢復正常飲食。

1.3 標本制備

上頜左側磨牙拔除1月后，各組隨機抽取5只，全麻，取左側上頜剩余牙槽骨，將所得的上頜剩余牙槽骨固定于多聚甲醛溶液，-4℃保存;上頜磨牙拔除2月后，各組隨機抽取5只，以同前的方法取材、固定、保存。將所得所有標本共同標記后，EDTA脫鈣，常規石蠟包埋，切片。

1.4 OPG/OPGL免疫組化染色

切片常規脫蠟，30%H2O2室溫下反應5-10 min滅活內源性酶，熱抗原修復10 min，室溫孵育40 min;滴加OPG一抗，濕盒4℃孵育過夜。染色中設陰性對照片，PBS代替一抗;室溫放置30 min，37℃復溫1 h;滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，濕盒37℃孵育40 min;滴加即用型SABC，室溫孵育40 min，DAB顯色3 min，Harris氏蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。OPGL步驟與OPG類似，均嚴格按照產品說明書執行。

1.5 免疫組化染色結果的判定

每張切片在LEICA光學顯微鏡下觀察染色情況，染色陽性部位由于反應沉積物而呈棕黃色。每個標本的骨界面平均取5個視野，轉至Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統，進行數碼拍照，并選定背景色與陽性染色為不同標記;單擊測量目標按鈕，測量得出平均灰度值，每張切片所測得的5個視野的均值為該切片的值，以平均灰度值代表蛋白的表達水平。

1.6 統計學分析

應用SPSS16.0軟件對數據進行分析。兩組間計量資料的比較采用LSD-t檢驗，以中毒劑量和拔牙后時間作為雙因素，采用雙因素方差分析，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 建模成功指標

建模6周時低、中、高劑量氟中毒組骨氟含量較對照組顯著升高(P＜0.05)，其差異具有統計學意義。各中毒劑量氟中毒大鼠血清堿性磷酸酶活性增高，但與對照組相比，其差異不具有統計學意義(P ＞0.05，見表1)。

圖1 骨保護素染色的結果Figure 1 OPG expression in residual alveolar bone in four groups by immunochemistry

圖2 骨保護素配體染色的結果Figure 2 OPGL expression in residual alveolar bone in four groups by immunochemistry

表1 各組血清堿性磷酸酶濃度、骨氟含量(±s)Table 1 The concentrations of serum ALP and bone fluorine content in four groups(±s)

表1 各組血清堿性磷酸酶濃度、骨氟含量(±s)Table 1 The concentrations of serum ALP and bone fluorine content in four groups(±s)

與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 血清ALP/(U/L) 骨氟/(mg/kg)對照組199.23±50.40 325.689±53.463低劑量氟中毒組 268.98±65.45 1 135.443±183.450*中劑量氟中毒組 268.49±52.78 2 104.878±593.457＊＊高劑量氟中毒組 269.43±28.87 4 098.932±835.601＊＊

2.2 OPG在氟中毒大鼠中的表達情況

OPG的陽性表達主要位于骨小梁周圍成骨細胞的胞質和胞膜，其胞質和胞核都呈彌漫成片的棕黃色陽性染色。OPG/OPGL的陽性表達隨著氟中毒濃度的增高而加強(圖1，見第752頁)。

與拔牙1月后相比，拔牙2月后時各劑量組OPG表達均降低，存在統計學差異。低劑量氟中毒組和中劑量氟中毒組與對照組比較，OPG表達少許增加，但無統計學意義。高劑量氟中毒組與對照組相比OPG表達減少，存在統計學差異(P＜0.05，見表2)。

表2 各組大鼠不同時間剩余牙槽骨中OPG的表達Table 2 The expression of OPG in residual alveolar bone in four groups at different time

2.3 OPGL在氟中毒中的表達情況

與OPG相比，各組OPGL灰度值均較高，且隨著中毒劑量的增加，表達顯著。OPGL表達部位和OPG相似，主要位于骨小梁周圍成骨細胞的胞質，呈棕黃色彌漫成片，骨細胞胞質和胞膜中亦可見表達，但染色較淡。各組氟中毒大鼠拔牙1月和2月后剩余牙槽骨中的OPGL表達相似，隨著時間的推移，表達降低(圖2，見第753頁)。

與拔牙1月后相比，拔牙2月后時各組OPGL表達均降低，其中高劑量氟中毒組減低顯著，存在統計學差異。拔牙2月后，與對照組相比，各中毒組的OPGL表達均增加，與對照組相比存在統計學差異(P ＜0.05，見表3)。

表3 不同時間各組大鼠剩余牙槽骨中OPGL免疫組化灰度值比較Table 3 The expression of OPGL in residual alveolar bone in four groups at different time

3 討論

牙槽骨不僅是天然牙行使正常功能的生理基礎，也是義齒修復的生理基礎，尤其對于全口義齒和種植義齒，牙槽骨的質和量在修復中起到舉足輕重的作用。牙齒缺失后，剩余牙槽骨會發生一種慢性的、進行性的、不可逆的、累積性的減少，我們稱其為剩余牙槽骨吸收(residual ridge resorption，RRR)。剩余牙槽骨在拔牙后6個月到2年內牙槽骨吸收迅速，以后逐漸減少，但維持終身。剩余牙槽骨吸收是很普遍的臨床問題，它給口腔修復帶來了一系列的問題，包括義齒固位不良，種植骨量不足，軟組織潰瘍以及義齒更換頻繁等。

研究表明，多種因素參與調節剩余牙槽骨的改建，其與全身代謝密切相關［6］。人體攝入的自然界中的氟元素能與骨組織的羥基磷灰石作用形成較為穩定的氟磷灰石結晶，低劑量時具有抑制骨吸收、促進骨形成的作用，而過量氟攝入則會引起機體骨組織破壞。研究顯示高氟區人群牙周組織破壞、牙齒喪失均高于低氟區［7］，作者推測處于高氟區的個體，其剩余牙槽骨的骨質可能不同于正常地區，其骨質到底發生了什么樣的變化呢?本實驗采用動物實驗的方法來觀察其改變。

骨保護素蛋白(OPG)為腫瘤壞死因子受體家族成員，是影響骨轉換的重要的細胞因子，具有抑制破骨細胞分化和活性的生理功能，它廣泛表達于多種組織和細胞系，在肺、心臟、脊髓和骨骼中表達較多。骨保護素(OPG)可以抑制骨吸收的觀點已被廣泛接受，很多學者研究了細胞因子和微量元素等對骨保護素對骨吸收的抑制的調節，氟可能引起大鼠血清OPG上升，抑制破骨細胞生成，破壞骨代謝平衡。以往的研究發現氟可能是通過誘導成骨細胞表達OPG增加，抑制破骨細胞的生成和分化，使骨吸收活動減弱，最終使骨組織病理形態向硬化型方向發展［8］。在本實驗中，各組氟中毒大鼠拔牙后上頜剩余牙槽骨中，OPG主要表達于成骨細胞和小量骨細胞中，胞質內棕黃色，其中低劑量氟中毒組和中劑量氟中毒組與對照組比較，OPG表達增加，這與張瑩等的研究一致。高劑量氟中毒組與對照組相比表達OPG減少，存在統計學差異，這可能是由于高劑量氟中毒直接刺激頜骨造成骨吸收，成骨細胞數量減少所致。

可見，雖然氟可以刺激成骨細胞增加，但是高濃度氟有可能導致骨細胞直接死亡。Fernandes等［8］研究表明，低氟可以刺激成骨細胞增多，而在過量氟的環境下，易發生凋亡現象，提示成骨細胞減少可能源于高氟導致的成骨細胞凋亡，使得鏡下骨細胞和成骨細胞相對減少，表達降低。與拔牙1月后相比，低、中、高劑量氟中毒組拔牙2月后OPGL灰度值均降低，并且存在統計學差異，提示隨著時間的推移，OPGL表達降低，對破骨細胞的抑制減弱，可能加速了剩余牙槽骨的吸收。

OPGL是腫瘤壞死因子配體家族成員，OPG是其的誘騙受體，位于成骨細胞譜系細胞表面的OPGL可以增強破骨細胞受體間的信號傳導。表達于成骨細胞胞膜上的OPGL結合于破骨細胞前體上的受體RANK，將信號傳導到NF-κB，或活化c-JUN末端激酶，調節基因表達，誘導破骨細胞的形成，增加骨吸收。OPGL mRNA由成骨細胞和骨髓基質細胞分泌，在骨組織中主要表達于成骨細胞系細胞，骨髓基質細胞，但OPG可競爭性地抑制OPGL與破骨細胞受體間的信號傳導，可調節OPGL來改變骨轉換。研究發現氟可能通過上調OPGL和M-CSF的表達來提高破骨細胞骨吸收的活性。范偉等［9］在燃煤型氟中毒大鼠中觀察到，低氟組、低氟偏食組大鼠干骺端OPGL表達增高，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。Sun等［2］研究表明，在氟的作用下，成骨細胞OPGL mRNA的表達呈上升趨勢，但沒有統計學差異。本實驗中，與對照組相比，低、中、高劑量氟中毒組的OPGL表達均增加，存在統計學差異(P＜0.05)，提示隨著氟中毒劑量的升高，剩余牙槽骨吸收加快。

人類剩余牙槽骨隨著時間在進行不間斷的吸收，研究表明在拔除牙體3-6個月后，剩余牙槽骨吸收趨于平穩。大鼠與人類剩余牙槽骨的病理改變極為相似，有學者［9-11］已經證實氟可通過刺激OPG來抑制骨吸收;可通過刺激OPGL來增強骨吸收。本實驗將OPG及OPGL在氟中毒大鼠剩余牙槽骨吸收的表達強度作為衡量剩余牙槽骨吸收的表征，對不同濃度氟中毒大鼠剩余牙槽骨吸收的程度做出評價，與拔牙1月后相比，低、中、高劑量氟中毒組拔牙2月后OPGL灰度值均降低，其中高劑量氟中毒組與1月相比存在統計學差異。提示隨著時間的推移，OPGL表達降低，尤其是高劑量氟中毒組，這可能與成骨細胞系細胞數目減少有關。但是相比較對照組而言，OPGL的表達都是增加的，提示氟化物通過刺激OPGL表達增加來加速牙槽骨的吸收，即氟濃度越高，骨質吸收越快。

綜上所述，長期氟中毒可導致大鼠剩余牙槽骨骨吸收加重，提示對于處于高氟地區的人群，可能會因為攝入氟化物過多而導致剩余牙槽骨吸收加速，并且存在骨實質受損，可能對后續的種植修復形成潛在的影響。

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