槲皮素干預下HBx基因對人肝癌細胞侵襲、遷移、增殖的影響

成碧萍，蘇 杰，姚 楊，白跳艷，徐 銳(西安醫學院第一附屬醫院中心實驗室，西安 710077;通訊作者，E-mail:yaoyang1220@sina.com)

流行病學和分子生物學研究認為，乙型肝炎病毒(HBV)是HBV相關性肝癌(HCC)發生的高危因素，HBx是HBV 4個開放讀碼框架中X編碼的一種病毒多功能蛋白，研究發現，X基因表達產物(HBx)在肝癌形成過程中參與肝癌血管生成［1］，可能通過多種復雜的細胞信號轉導途徑參與細胞凋亡、DNA修復調控，促進細胞周期進程，與HCC的發生、發展具有密切的關系［2，3］。因此，以 HBx作為肝癌基因治療靶點具有一定的臨床應用前景。隨著對腫瘤治療研究不斷的深入，發現廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物有抗腫瘤的作用［4］。近年來研究［5］表明，槲皮素能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖、轉移，能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡及增強其他抗腫瘤藥物作用的敏感性。本文就槲皮素對體外培養的人肝癌HepG2細胞及穩定轉染 HBx基因的HepG2-X的侵襲、遷移及增殖的影響進行了研究，進一步探討槲皮素的功能及其可能機制，另外，本文研究HBx在槲皮素干預下對HepG2細胞增殖的影響，探討HBx致肝細胞惡性轉化的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌HepG2及HepG2-X細胞株由西安醫學院附屬醫院中心實驗室提供，槲皮素購自美國Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解后-20℃保存，實驗時用RPMI1640培養基稀釋。MTT和DMSO購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所。

1.2 細胞培養

從液氮罐中取出凍存管，40℃水浴融化，1 500 r/min離心3 min后棄上清;沉淀物用RPMI1640完全培養液混懸后適量培養液稀釋，轉入無菌培養瓶;在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的孵箱中培養;次日更換培養液，繼續培養。每2 d換液1次，待細胞鋪滿70%-80%培養瓶時，用2.5 g/L的胰酶消化，完全培養基終止反應，滴管吹打為單個細胞，1∶4分瓶傳代。選擇對數生長期的細胞收集，在收集前1 d換液1次，用胰酶消化為單個細胞懸液，離心，棄上清，加入凍存液，以1×106/ml的密度混懸細胞，將細胞懸液轉至凍存管，標記好后置于4℃冰箱30 min，轉至-20℃冰箱2-3 h，然后放入-80℃冰箱暫存，最后置于液氮罐中長期保存。

1.3 MTT法觀察細胞增殖并測定槲皮素對細胞增殖的影響

實驗分為槲皮素處理組和DMSO對照組(含0.02%的DMSO)。將傳代的HepG2及HepG2-X細胞培養板中的原培養基吸出，分別加入溶于DMEM培養基中的槲皮素，其終濃度為0(空白對照組)，10，20，40，80 μmol/L，每個濃度設 3 個復孔，分別培養24，48，72 h后，吸去孔內上清液，每孔加入150 μl的二甲亞砜，振搖溶解結晶后酶聯免疫檢測儀于595 nm波長處分別測定各孔吸光度(A)值，取其均數作為本次A值計數值。以時間為橫軸，A值為縱軸繪制各組細胞生長曲線圖，同樣采用MTT法測定并計算細胞生長抑制率(IR)。IR=(對照組A值均數-實驗組A值均數)/對照組A值均數×100% 。IR值越高，抑制作用越強。

1.4 細胞體外侵襲試驗

Matrigel膠4℃過夜融化，與無血清RPMI1640培養基按1∶1 比例稀釋，以 60 μl/孔在 Transwell上室進行鋪膠，37℃放置于通風櫥3 h使其成膠。經10，20，40，80 μmol/L 濃度的槲皮素處理細胞，胰蛋白酶消化，使細胞懸浮，經離心收集后用無血清RPMI1640 稀釋成5 ×105個/ml，取200 μl細胞懸液加入Transwell上室中，下室加入500 μl含血清 RPMI1640培養液。常規條件下培養36 h，取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的上室細胞，PBS漂洗1次，4%的多聚甲醛固定30 min，PBS再次漂洗2次，Giemsa染色30 min，雙蒸水沖洗。取下微孔濾膜，置于倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計算基底膜下細胞，以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力，每組設3個復孔，重復4次。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度槲皮素對細胞增殖的作用

MTT法檢測各組細胞A值發現，HepG2-X細胞在24 h、48 h和72 h的A值均明顯高于HepG2細胞(P＜0.05，見圖1，2)，表明 HepG2-X 細胞生長速度明顯加快，顯示HBx對HepG2細胞具有促進增殖作用。各組中隨著槲皮素濃度的增加，所測得的A值逐漸降低，與空白對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，槲皮素處理組細胞增殖被明顯抑制，隨濃度的增加其抑制作用逐漸增強，槲皮素在濃度80 μmol/L時細胞增殖抑制最為明顯;不同濃度的槲皮素處理組作用后抑制率(IR)隨著時間的增加而升高，各組較前時間點差異具有統計學意義(P＜0.05，見表1，2)，且抑制作用與時間及濃度呈明顯正相關。

圖1 不同濃度槲皮素對HepG2-X細胞增作用的影響Figure 1 The inhibitory effect of different concentrations of quercetin on HepG2-X cells proliferation

表1 槲皮素對HepG2-X細胞作用不同時間的A值及生長抑制率Table 1 The absorbance and inhibitive rate of HepG2-X cells at different time after quercetin treatment

表2 槲皮素對HepG2細胞作用不同時間的A值及生長抑制率Table 2 The absorbance and inhibitive rate of HepG2cells at different time after quercetin treatment

2.2 槲皮素可抑制肝癌細胞的侵襲遷移的抑制

Transwell體外侵襲實驗研究結果見圖3，結果表明，HepG2細胞具有較強的侵襲能力，槲皮素處理36 h后，其侵襲能力明顯減弱，與對照組遷移率100%相比，10，20，40，80 μmol/L 槲皮素處理組與空白對照組相比穿過濾膜的HepG2細胞明顯減少，遷移細胞比率分別為91.82%，67.72%，48.20%，27.80%(P＜0.05);各處理組中不同濃度槲皮素作用后穿過濾膜的細胞數量隨槲皮素濃度增加而減少。

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于植物、食物及中草藥之中。據報道，黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、防癌、抗癌等作用［6］。我國每年約有11-13萬人死于原發性肝癌，占全球肝癌死亡數的半數之多。在誘發肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的眾多因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染占到 50% 以上［7］。因此迫切需要尋找一種有效的臨床治療方法。槲皮素為黃酮類的一種，研究發現，槲皮素能有效抑制結腸癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌以及乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖和誘導腫瘤細胞凋亡［8-12］。本實驗進一步探討槲皮素對人肝癌HepG2細胞的影響，及HBx干預下對其影響，旨在為槲皮素應用于肝癌的臨床治療提供依據，以及將HBx作為肝癌基因治療提供理論基礎［13，14］。

圖3 槲皮素對HepG2細胞侵襲能力的抑制Figure 3 Inhibitive effect of quercetin on the invasion of HepG2cells

本實驗通過Transwell侵襲小室模型在體外進行腫瘤細胞侵襲能力檢測，觀察到HepG2細胞具有較強的侵襲能力，加入槲皮素后，其侵襲能力明顯減弱，呈濃度依賴性，說明槲皮素可抑制肝癌細胞的侵襲能力。此外采用 MTT檢測 HepG2-X細胞和HepG2細胞的增殖情況表明，槲皮素對兩組細胞的生長活性具有抑制作用，其增殖抑制率與作用時間和劑量呈明顯的相關性，隨藥物濃度增大作用時間延長，抑制率明顯升高。以上結果表明，HBx可能促進肝細胞癌變或增強癌細胞的增殖及侵襲能力，槲皮素能夠抑制肝癌細胞HepG2的增殖及侵襲力，作用機制還有待進一步研究。

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