瘢痕疙瘩成纖維細胞中有關傳導分子mRNA水平的實驗研究

弓軍勝，馮瑞錚，余睿芳(山西醫科大學第一醫院整形科，太原 030001;通訊作者，E-mail:frz1121@sina.com)

瘢痕的形成與成纖維細胞內高表達轉化生長因子 β(transforming growth factor-beta，TGF-β)信號關系密切［1］。TGF-β/Smads信號通路異常活化，能有效地刺激瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、合成和分泌大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，最后導致瘢痕的形成。TGF-β誘導早期基因(TGF-β inducible early gene，TIEG)能夠模擬 TGF-β/Smads信號通路的生物學效應，增強TGF-β/Smads的轉錄因子的調控作用，并且發現TIEG增強Smads信號通路的作用是通過上調Smad2基因轉錄，抑制Smad7啟動子附近特殊的反應元件實現的［2］。

本課題將通過對正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細胞體外培養的實驗研究，對其TGF-β/Smads信號傳導通路中有關傳導分子 mRNA(如 TIEG、Smad2、Smad7)的表達情況進行比較，并探討相關意義，為今后臨床應用提供一定的理論和實驗指導。

1 材料與方法

1.1 材料

瘢痕疙瘩標本取自我院就診治療的患者50例。無結締組織、心、肝、腎、肺等疾患，6個月內未使用類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物等，且未曾接受放療。將標本漂洗數次，分別去除上皮，分別切成5塊2 mm×2 mm大小的組織塊，送入無菌培養瓶中，加入RPMI1640培養液，培養4 h后將培養瓶翻轉，另加5 ml培養液及少量胎牛血清繼續培養。每3-4 d換液一次。待培養的成纖維細胞長滿瓶底后，PBS漂洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，繼續培養［3］。取第5代之內的細胞用于本實驗研究。

1.2 方法

1.2.1 細胞總RNA的提取 分別取瘢痕疙瘩與正常皮膚組織的細胞共100例，并將其按Tripure Reagent總RNA分離試劑盒說明進行提取RNA。

1.2.2 提取的總RNA的濃度、純度測定和完整性分析 用紫外分光光度儀分別測定在260 nm和280 nm波長處的吸光度(OD260和OD280)，通過以下公式計算RNA的濃度:RNA(μg/μl)=OD260×40/1 000×稀釋倍數，同時計算 OD260和 OD280的比值(OD260/OD280)，當比值接近于2.0時，說明提取的RNA較純，可用于后續實驗，-70℃保存。利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行完整性的鑒定。

1.2.3 RT-PCR 用總RNA制備cDNA:在2 5 μl反應體系中包括1 μg 待檢總 RNA，2 μl Oligo(dT)，5 μl AMV Buffer，5 μl 三 磷 酸 脫 氧 核 糖 核 苷(dNTP)，0.5 μl RNA 酶抑制物，l μl禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶，0.1%焦碳酸二乙酶(DEPC)水13.5 μl，42 ℃水浴1 h 后，5 ℃ 5 min 破壞反轉錄酶終止反應。冰浴5 min后-70℃保存。

PCR擴增β-actin以及各個目的基因:在50 μl反應體系中包括 2 μl cDNA，5 μl 10 ×Taq Buffer，上游引物、下游引物各 1 μl，4 μl 25 mmol/L MgCl2，8 μl dNTP 的混合物，濃度為 2.5 mmol/L，1 μl Ex Taq DNA 酶(5 U/μl)，28 μl去離子水。具體引物序列見表1。

表1 有關傳導分子引物序列Table 1 Sequencing of primers

PCR反應條件如下:94℃ 5 min預變性，隨后進行35個循環，94℃ 1 min變性，52-58℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，最后72℃ 10 min充分延伸。反應結束后，取10 μl PCR產物電泳鑒定，以明確擴增產物的數目和大小。

1.2.4 電泳條帶的光密度計算和統計學分析 對各電泳條帶的光密度定量分析，RT-PCR產物以各組細胞的目的基因與β-actin的光密度比值進行比較，實驗數據均以±s表示，實驗結果進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

用Tripure提取成纖維細胞總RNA，用變性的甲醛電泳證實了所提取的總RNA的比值約為2∶1，圖1中可見其中6個樣本清晰的28 s、18 s和5 s三條帶，而且28 s與18 s的比值約為2∶1，表明提取的RNA結構完好，無降解。

圖1 成纖維細胞提取的RNA凝膠電泳圖(從左至右依次為6個樣本的電泳帶)Figure 1 Gel electrophoresis of extracted RNA in keloid fibroblasts

采用RT-PCR法，從成纖維細胞中擴增出了相應的目的基因cDNA片段。瘢痕疙瘩成纖維細胞組TIEG、Smad2 mRNA表達水平明顯高于正常皮膚成纖維細胞組，而Smad7 mRNA表達水平明顯低于正常皮膚成纖維細胞組，差異有統計學意義(P＜0.05，見表2及圖2)。

表2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組成纖維細胞中各基因mRNA表達水平 (n=100)Table 2 The mRNA levels of TIEG，Smad2，Smad7 in fibroblasts of keloid tissues and normal controls(n=100)

3 討論

創傷愈合時過度的組織纖維化導致瘢痕疙瘩形成，在此過程中TGF-β與受體的過度表達是一個關鍵的因素。TGF-β分泌活躍的細胞出現在傷口部位時，可以通過自分泌和旁分泌作用來加強其致纖維化的作用。

TGF-β/Smads信號通路中 TGF-β的生物學效應主要通過細胞內的 Smad蛋白介導［4］，其中受體調節性Smads(Smad2，Smad3)起著正性調節作用，促進瘢痕的形成，抑制性Smad(Smad7)發揮負反饋調節作用［5］，抑制瘢痕的進展。而TGF-β致纖維化的效應主要是通過促進細胞外基質(ECM)合成，抑制ECM降解，最終導致ECM的積聚。

圖2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組成纖維細胞中各基因mRNA表達電泳圖Figure 2 The mRNA expression of TIEG，Smad2，Smad7 mRNA in fibroblasts of keloid tissues and normal controls by RTPCR

本研究顯示瘢痕疙瘩成纖維細胞中，TIEG mRNA水平的表達遠高于正常皮膚成纖維細胞，可見TIEG以及TGF-β的過度表達與瘢痕疙瘩發生、發展有密切關系。進一步又分析了Smad蛋白的表達，顯示瘢痕疙瘩中表達Smad2 mRNA增強，表達Smad7 mRNA減弱，說明 TIEG能夠模擬 TGF-β/Smads信號通路的生物學效應并依賴于 Smad2，TIEG過度表達能下調內源性Smad7并上調Smad2基因轉錄。

最新研究表明細胞外基質主要成分的基因啟動子上存在Smads蛋白的結合位點［6］，一些參與細胞外基質調控如CTGF、α-SMA、Smad7等的基因啟動子上亦發現有 Smads蛋白的結合位點［25，26］。TGF-β可通過Smads信號蛋白調節上述靶基因的表達，參與組織纖維化的發生與發展。

［1］ Meran，S;Thomas，DW:Stephens，P，et al.Hyaluronan facilitates transforming growth factor-beta(1)-mediated fibroblast proliferation［J］.J Biol Chem，2008，283:6530.

［2］ 楊娥，鄒崎葩，張恒術.DNA甲基轉移酶1在人瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及意義［J］.中華整形外科雜志，2013，29(2):117-120

［3］ Gordon，Kelly J;Blobe，Gerard C.Role of transforming growth factor be to superfamily signaling pathways in human disease［J］.Biochim Biophys Acta，2008，4(1978):197

［4］ 繆澤群，宋韜.TGF-β1調節瘢痕疙瘩成纖維細胞分泌MMP-1及TIMP-1的研究［J］.中國麻風皮膚病雜志，2013，29(6):373-375.

［5］ 弓軍勝，蘭麗珍，孫遼.載體介導的siRNA抑制TIEG在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達［J］.中國藥物與臨床，2007，7(2):106-108.

［6］ 刁建升，馬顯杰.瘢痕疙瘩發病機制和藥物治療研究新進展［J］.中國美容整形外科雜志，2013，24(3):187-189.