中醫藥對卵巢TGF-β/Smad信號轉導的干預及思考

申可佳，尤昭玲

（1.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學附屬第一醫院，湖南 長沙 410208）

中醫藥能促進卵泡發育成熟，改善卵巢功能和卵母細胞質量，輔助提高妊娠率，這些療效通過長期臨床實踐已得到肯定，但作用機制未完全闡明。以往的研究多集中在補腎中藥對卵巢相關細胞因子及受體表達的影響、對性腺軸激素及受體的調節等方面，關于這些被調節的因素最終通過何種分子機制產生生物學效應不甚明了。細胞信號轉導是指細胞接受外源信號，將其轉化為胞內信號，最終調節特定基因表達的過程。卵巢內的信號轉導通路非常復雜，包括G蛋白介導的信號轉導途徑、蛋白酪氨酸激酶（PTK）信號轉導途徑、蛋白絲/蘇氨酸激酶信號轉導途徑等，現已證實轉化生長因子-β（TGF-β）超家族/Smad信號轉導通路是調控卵泡發育的重要途徑[1-2]。本文綜合近年文獻，首先總結TGF-β/Smad信號轉導通路對卵泡發育的調控，然后分析目前中藥對此通路的干預作用，希望能對中藥作用機制的研究有所啟發和幫助。

1 卵巢內的TGF-β超家族/Smad信號轉導通路

TGF-β超家族/Smad信號轉導通路屬于蛋白絲/蘇氨酸激酶信號轉導途徑，由TGF-β超家族、TGF-β超家族受體和Smads蛋白家族三部分組成。

TGF-β超家族 轉化生長因子-β（TGF-β）超家族是一組結構相關、功能多樣的細胞因子家族，主要包括TGF-β、激活素（Activin）、骨形成蛋白（BMP）、生長分化因子（GDF）等，它們參與調節哺乳動物的多種生理活動，在卵泡的發育中也起著重要作用[3-4]。

1.1 轉化生長因子-β（TGF-β）

多種組織細胞可合成TGF-β，以自分泌或旁分泌方式調節細胞的生長和分化。目前發現至少有5個亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5，各亞型在許多生物反應中表現出相似的作用。其中TGF-β1所占比例最高（＞90%），活性最強，是一種多功能的細胞活性調節因子，在胚胎發生、脂肪形成、肌肉形成、軟骨形成、骨發生、上皮細胞分化、纖維發生以及免疫細胞的功能調節方面發揮重要作用[5]。

1.2 激活素（activin）、抑制素（inhibin）、卵泡抑素（follistatin）即ACT-INH-FS

ACT-2NH-FS系統均為TGF-β超家族成員，主要由垂體和卵巢顆粒細胞分泌。抑制素有抑制素A（INHA）及抑制素B（INHB）2種化學結構相似的亞型，兩者均可選擇性反饋抑制垂體促卵泡素（FSH）的合成和分泌，在卵泡募集和優勢卵泡的選擇中起作用。激活素有激活素A（ACTA）、激活素B（ACTB）和激活素AB（ACTAB）3種亞型，為抑制素的同源或異源二聚體（激活素A：βAβA，激活素B：βBβB）及異源二聚體（激活素AB：βAβB），其作用與抑制素相反，可以促進垂體FSH分泌，調節顆粒細胞的分化，激活素A還有促進卵泡發育的作用。卵泡抑素（FS）是激活素的結合蛋白，通過與激活素的不可逆結合間接抑制FSH的合成與分泌，對抗激活素對卵泡的作用。目前認為ACT-INHFS作為一個系統，通過內分泌途徑對垂體FSH的合成和分泌進行反饋調節，并在卵巢局部通過自分泌或旁分泌的途徑，調節卵泡膜細胞和顆粒細胞對促性腺激素的反應性，故此系統與卵泡的發育密切相關，是參與卵泡發育的主要的卵巢內部因子[6-9]。

1.3 抗苗勒氏管激素（AMH）

AMH是TGF-β超家族成員之一，參與卵泡的發育過程。AMH在始基卵泡中無表達，在竇前卵泡和小竇卵泡（直徑≤4 mm）的顆粒細胞中高表達，在4～8 mm卵泡中表達量逐漸下降，而在8 mm以上的竇卵泡中AM H表達消失，在閉鎖卵泡中亦無表達。目前發現AMH主要通過抑制始基卵泡發育的起始及抑制卵泡對FSH的敏感性這兩方面來抑制卵泡發育，并且發現AMH是預測卵巢儲備功能和卵巢反應性的良好指標之一[10-11]。

1.4 骨形成蛋白（BMP）

目前的研究已發現BMP有10多種亞型，由不同的細胞在卵泡發育的不同階段分泌，比如BMP-15是卵母細胞來源的因子，動物實驗研究證明其能調控周圍顆粒細胞的分裂，對正常卵母細胞發育及生殖功能具有重要的影響[12]。BMP-6可由卵母細胞和顆粒細胞分泌，目前認為可能與優勢卵泡形成后的卵泡閉鎖相關。顆粒細胞還能分泌BMP-2和BMP-3，有研究顯示BMP-2重組體可以增強綿羊顆粒細胞中的FSH引導的雌激素（E2）和抑制素A的產生， 刺激抑制素B亞組mRNA的表達以及體外培養的人類粒層黃體細胞中抑制素B蛋白的產生。BMP-3在卵巢中的生化作用還不清楚。已有發現大鼠的卵泡膜細胞可以產生BMP-3b、BMP-4和BMP-7，其中BMP-4和-7的重組體可以通過促進FSH誘導的E2的生成和抑制孕酮的生物合成來調控FSH的信號傳導[13]。

1.5 生長分化因子（GDF）

GDF-9 和GDF-9B主要在人類和其他哺乳動物的卵巢表達，GDF-9是卵泡正常生長發育必需的細胞因子，它通過自分泌方式促進卵母細胞進行有絲分裂，通過旁分泌的方式調節顆粒細胞和卵泡膜細胞的增殖分化，同時影響卵巢內類固醇激素、蛋白酶及其他細胞因子的分泌[14]。GDF-9B可能通過和GDF-9共同作用來調節顆粒細胞的功能， 比如促性腺激素誘導的增生和分化[13-14]。

選取2017年3月～2018年5月我院內接診的帶狀皰疹神經痛患者82例作為研究對象，按照治療措施的差異將其分為兩組。其中，對照組男20例，女21例，年齡22～55歲，平均（56±1.44）歲，體質量70～85 kg，平均（80.44±1.25）kg；觀察組男15例，女26例，年齡21～55歲，平均（50.85±1.79）歲，體質量72～85 kg，平均（80.44±1.12）kg。對比分析兩組患者一般資料，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2 TGF-β超家族受體[5,15-16]

TGF-β超家族受體通過與配體（TGF-β超家族）的結合及活化，啟動Smad信號轉導通路。目前共發現8種受體，即受體Ⅰ（TβRⅠ），受體Ⅱ（TβRⅡ），受體Ⅲ（TβRⅢ），受體Ⅳ（GH3），Endoglin，PLBPs（含有可結合TGF-β1和TGF-β2的兩種受體），GI-210。其中研究得比較清楚的為TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ，這3種受體具有較高的同源性，且TβRⅠ和TβRⅡ 均為具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分為細胞外配體結合區、跨膜區和胞內絲-蘇氨酸蛋白激酶區。

2.1 TβRⅠ又稱為活化素樣蛋白激酶（Alks），可分為Alk5、Alk3和Alk1三個亞群。

Alk5亞群包括TGF-βⅠ型受體Alk5、激活素受體Alk4和Nodal受體Alk7；Alk3亞群包括BMPⅠ型受體Alk3和Alk6；Alk1亞群包括同BMP /GDF和TGF-β/Activin作用的Alk1和Alk2。TβRⅠ的C端含有一個保守的Gs結構域（Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly），是接受TβRⅡ磷酸化激活的部位，具有傳遞信號的作用。

2.2 TβRⅡ 包括TGF-βRⅡ，Activin RⅡ，Activin RⅡB，BMP /GDFⅡ型受體（BMP RⅡ），AMH的Ⅱ型受體（M IS RⅡ）。

2.3 TβRⅢ 亦稱為β烯糖，無信號轉導結構，但可提高配體對TβRⅡ的親和力。

3 Smads蛋白家族[5,17-18]

Smads蛋白家族是目前已被證實和公認的TGF-β超家族受體作用的底物，能將從TGF-β獲得的信息傳遞到細胞核內。Smads家族的蛋白結構具有高度的同源性，一級結構由三部分組成：高度保守的氨基端即MH1區、高度保守的羧基端即MH2區以及富含脯氨酸的連接區。在介導TGF-β超家族信號時，MH1區發揮與DNA結合的作用，MH2結構域可調節靶基因的轉錄。

根據Smads蛋白在信號轉導中的不同作用可將其分為3類：（1）受體激活型Smads（receptor-activated Smads）或途徑限制型（pathway-restricted Smad）：即R- Smads，包括Smad 1、2、3、5、8、9、10。其中Smad 1、5、8、9參與BMP的信號轉導，Smad2、3 參與TGF-β和Activin的信號轉導，而Smad10主要參與激活BMP 拮抗劑（神經誘導及發育的關鍵因子）與成纖維細胞生長因子（FGF）的活性。（2）共同介質型或通用型Smads：即co-Smads，包括Smad4，有1個富含脯氨酸的Smad4活化區，是激活依賴Smad蛋白的轉錄反應所必需的。Smad4可以與所有已活化的R-Smads結合，是BMP、TGF-β和Activin信號轉導途徑的共同通路。（3）抑制型Smads：即I-Smads，包括Smad6、7，可拮抗R-Smads介導的信號傳導，形成控制TGF-β超家族作用的負反饋環路。

4 卵巢內TGF-β超家族信號的轉導[5,7,11,13-18]

TGF-β超家族成員（配體）在細胞外先與TβRⅢ形成復合物，再被傳遞給處于自動磷酸化的TβRⅡ，或配體直接與TβRⅡ結合形成二元復合物，隨后磷酸化激活TβRⅠ，形成三元/二元復合物，使TβRⅠ在靶細胞內與膜受體偶聯的GS區活化，并與之形成信號復合物，隨后激活R-Smads蛋白MH2區的受體磷酸化位點（SSXS基序）。活化的R- Smads與co-Smads即Smad4形成異多聚體， 然后進入細胞核中，通過Smad4和Smad3的M H1區與DNA上的Smad結合元件松散結合，在局部一些轉錄共激活因子和／或共抑制因子的影響下，MH2區的轉錄激活序列與靶基因形成緊密結合，最終實現信號轉導。I-Smads不能被受體磷酸化，但可競爭性地與活化的TβRⅠ牢固結合，阻止R-Smads的磷酸化，從而負反饋控制TGF-β信號的強度和持續時間。

4.1 Smad2/Smad3介導的通路

已證實TGF-β、Ac tiv in、GDF-9可通過細胞內Smad2/Smad3的介導完成信號傳遞。

4.1.1 GDF-9來源于卵母細胞和顆粒細胞，通過自分泌和旁分泌方式作用于靶細胞（卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞）的BMP RⅡ，再激活受體Alk5，隨后激活靶細胞內Smad2/ Smad3，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成多聚體，進入核內調控靶基因的轉錄。目前已發現GDF-9可以引起顆粒細胞的透明質酸合成酶2（Has2）、環氧化酶2（Cox2）和類固醇生產的敏感調節蛋白（StAR） mRNA的表達， 而抑制尿激酶型纖溶酶原激活物（uPa）和黃體化激素受體（LHR）的表達。

4.1.2 ACT、INH、FS來源于卵巢顆粒細胞，在卵巢內部通過自分泌和旁分泌方式作用于顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞，其中ACT作用于靶細胞的activin RⅡ，再激活受體Alk4，隨后激活靶細胞內Smad2/Smad3，并與Smad4形成多聚體，進入核內調控靶基因的轉錄。目前發現ACT可調節顆粒細胞的分化， 并且和卵泡的發育階段相關。體外培養未分化的大鼠顆粒細胞發現ACT可促進其表達芳香化酶、促卵泡素（FSH）和黃體生成素（LH）受體， 刺激雌二醇（E2）和孕酮（P）的分泌，并且上述作用不依賴于FSH，但可被FSH增強。同時，ACT促進顆粒細胞INH的基礎分泌和FSH誘導的分泌及其INH亞單位的表達。INH、FS的信號通路暫未明確。

4.1.3 TGF-β由卵母細胞和卵泡膜細胞產生，作用于顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞的TGF-βRⅡ，再激活受體Alk5，接下來的細胞內信號途徑同GDF-9。

4.2 Smad1/ Smad5/ Smad8介導的通路

已證實BMP、AMH可通過細胞內Smad1/ Smad5/ Smad8的介導完成信號傳遞。

4.2.1 BMP 卵母細胞分泌BMP-15和BMP-6，顆粒細胞分泌BMP-2、BMP-3、BMP-6、BMP-7，卵泡膜細胞分泌BMP-3、BMP-4、BMP-7，這些亞型均可通過旁／自分泌作用于靶細胞的BMP RⅡ，然后激活受體Alk2，Alk3和Alk6，活化的受體在磷酸化激活細胞內Smad1/ Smad5/ Smad8，后者與Smad4形成多聚體，進入核內調控靶基因的轉錄。不同亞型引起的生物學效應見前述（1.4）。

4.2.2 AMH由卵巢顆粒細胞表達，作用于顆粒細胞和卵泡膜細胞的MISRⅡ，然后激活受體Alk2，Alk3和Alk6，接下來的信號轉導途徑同BMP。

5 中醫藥對卵巢內TGF-β/Smad信號轉導的干預及思考

細胞信號轉導是非常復雜的過程，涉及胞外配體、跨膜受體、胞內各種信使分子等，機體某種生理和病理現象的產生往往涉及眾多的信號轉導通路，且多條通路錯綜復雜，譬如卵泡的發育，是眾多細胞因子和激素（胞外配體）通過多條信號轉導通路來調控的，很多過程還未弄清楚。所以選取一條研究得比較成熟、已得到公認的轉導通路很關鍵，TGF-β超家族/Smad信號轉導就是目前已被證實的、和卵泡發育密切相關的通路。以往文獻報道的大部分研究集中在中醫藥對卵巢內TGF-β超家族（配體）的調節，如對ACT-INH-FS、AMH、BMP、TGF-β1等的調節，對受體和胞內信號分子的研究較少，對細胞內Smads蛋白的干預研究更是鳳毛麟角，如孫麗萍等[18]報道四物合劑通過升高小鼠卵巢顆粒細胞P-Smad2/3的表達以維持芳香化酶表達水平的正常，維持卵巢的正常分泌功能，對卵巢形態和顆粒細胞增殖亦有保護性作用，對于臨床防治化療性卵巢早衰具有一定的可行性。崔瑞琴等[19]報道菟絲子黃精顆粒劑可干預和修復雷公藤多苷所致雌鼠卵巢損傷，其機制是菟絲子、黃精可以促進被雷公藤多苷所抑制的卵巢組織中Smad4 mRNA的表達。雖然中醫藥干預卵巢細胞內Smads蛋白的文獻很少，但已發現較多中醫藥干預骨質疏松癥骨組織和下丘腦等部位TGF-β/Smad轉導通路的研究[20-23]，這些研究為中藥對卵巢內TGF-β/Smad信號轉導的干預揭開冰山一角，啟發我們從新的角度闡明中醫藥干預卵泡發育的機制。

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