急性毒性試驗研究進展

袁 媛，邱 霞

急性毒性試驗(acute toxicity test)是大劑量高濃度藥物1次給予試驗動物，目的是了解外源性化合物短期內的毒性作用，并對診斷、預防和急救治療提供科學依據。現就急性毒性試驗的研究進展作一綜述。

1 對半數致死量(LD50)的重新評價

毒理學家通過長期實踐，發現同一化合物，用同一品系動物，同樣的實驗條件和方法，卻得出不同的LD50值，甚至相差幾倍。LD50實際上是對試驗動物結果進行數學處理后計算產生的一個數值。毒理學評價應具備中毒表現、出現中毒和持續的時間，毒性涉及臟器的損傷程度、可逆性質、死亡過程及死亡原因等系列毒性資料[1]。實際上急性毒性試驗應從定性和定量兩個方面進行觀察和研究，否則容易造成錯誤的評價。LD50只是毒性測試的第一步，遠不能回答急性試驗的全部內容。

2 LD50代替法的興起

早在1876年英國政府就頒布了“關于禁止虐待動物法”，在《動物實驗法則》中明確規定大學畢業經考核合格，持有許可證方可參與或在監督下進行動物實驗。1959年，在動物學家William Russell和微生物學家Rex Burch發表的《人道的動物試驗技術原則》中提出了應用動物研究的3Rs原則，即替代(replace)、減少(reduce)和優化(refine)，即在生命科學研究中應采取其他手段來代替動物實驗、改進實驗方法、減少動物數量和痛苦，但沒有引起世人的重視[2]。 直至20世紀80年代，許多國家成立了代替法組織，并組織了代替法國際會議，北京實驗動物學會也成立了該組織，并參加了國際會議。在世界性保護動物組織的壓力下，目前各國都在研究LD50代替法，并取得了一定進展，但動物實驗無法完全被其他技術所代替，因此盡量減少實驗動物用量，將是今后探討的方向。

3 幾種新的急性毒性評價方法

3.1 固定劑量法(fixed dose procedure，FDP) 本法設固定劑量、觀察動物反應，不以死亡為依據，而且按毒性癥狀來判斷該物質的危險程度。這樣一個試驗只需10～20只動物。設5、50、300、2000 mg/kg 4個劑量組，(必要時可以增加至5000 mg/kg)，依次使用同一性別的動物(一般為雌性)，經口染毒。根據預試驗結果，確定會發生毒性反應但不產生嚴重的毒性反應或死亡的劑量作為起始劑量進行試驗，再根據觀察的結果調整毒性劑量，當出現以下情況時終止試驗：(1)出現明顯的毒性反應或已確認不多于1只動物死亡；(2)最高劑量未出現毒性反應；(3)最低劑量動物出現死亡。

此法早在1984年由英國毒理學會提出，經布魯塞爾協議后歐洲委員會出資50萬英鎊，由美國、日本、歐洲等33個研究室共同進行20個化合物的新舊方法急性毒性試驗對比，其毒性分級一致率為87.2%。結果證實可以代替從1927年以來沿用的LD50法，而且為危險度評價提供了對急性毒性所需的足夠資料，包括中毒作用性質、中毒發生時間、持續時間和結局等。布魯塞爾委員會也承認了固定劑量法的實用價值。

3.2 急性毒性分類法(acute toxic class method，ATC) 急性毒性分類法是由Sumiey于1990年提出的一種評估化合物急性毒性的簡單方法[3]，每性別每一劑量僅用3只動物，首先用2000 mg/kg劑量，如無死亡即可結束試驗，因為LD50一般為最大無致死劑量(MNLD)的2～2.5倍。這意味著化合物在2000 mg/kg劑量時無動物死亡，其LD50大約為400～5000 mg/kg，因此就沒有必要進一步做致死劑量的試驗。如有死亡則應用200 mg/kg繼續試驗。用本法估算的LD50與傳統的LD50試驗結果基本一致。

3.3 上下法(up-and-down procedure，UDP) 上下法作為經濟合作與發展組織(organization for economic cooperation and development，OECD)于2001年新修訂發布的急性毒性試驗方法之一，是傳統急性毒性試驗的一個替代方法，有著巨大的應用價值和發展前景。

上下法由限度試驗和主試驗組成。限度試驗又分為2000 mg/kg和5000 mg/kg劑量水平，用于受試物毒性可能較小的情況。2種劑量的限度試驗具體步驟有細微差別，但最多僅用5只動物。設計限度劑量5000 mg/kg，將受試物按5000 mg/kg給予1只動物。觀察48 h，如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，依次將受試物給予另外2～4只動物。有3只或3只以上動物存活時，LD50大于5000 mg/kg；有3只或3只以上動物死亡時，LD50小于5000 mg/kg[4]。主試驗是一個預先設計的給藥程序，在此程序中，每次給藥1只動物，若該動物存活，第2只動物給予高一級劑量，若第1只動物死亡或出現瀕死狀態，第2只動物給予低一級劑量。在對每只給藥動物仔細觀察48 h后，可以決定是否對下1只動物給藥，以及給藥劑量。當最高劑量下有連續3只動物存活，或在6只動物中有5只連續發生在高一級劑量死亡、在低一級劑量生存的生死轉換等情況時，可以停止試驗。根據終止時所有動物的狀態，用最大可能性法計算LD50值[5]。

在應用上下法進行急性毒性試驗中，起始劑量的設計十分重要。在指導原則中，要求起始劑量的設計比最接近LD50估計值的劑量低一級。這樣不但能夠減少上下法中使用的動物數量，也可以使得到的試驗結果更加準確。除了起始劑量外，組距的確定也對試驗結果有較大影響，不同劑量級數因子的選擇可以改變LD50及95%置信區間[6]。可以使用最大相似法計算LD50值以及95%置信區間。在整個主試驗過程中，劑量級數因子應選定為1/(劑量-反應曲線斜率估計值)的反對數。默認假設通常為1.3(Sigma=0.12)的劑量級數因子適于很廣泛的化合物，可以作為大多數化合物的大致估計值，用它進行試驗得到的LD50與Sigma在0.05～0.25之間的化合物的LD50均無明顯差異，對毒性分級就更加沒有影響了[7]。

與傳統的急性毒性試驗方法相比，上下法具有很多明顯的優點，主要表現在以下幾方面：(1)符合維護動物福利的要求[8-9]。(2)能夠得到LD50的估計值及相應的置信區間[10]。(3)能夠觀察毒性表現。(4)所需的受試物量少[11]。(5)應用計算機程序進行數據分析，實用性強。

盡管上下法與傳統方法相比有了很多改進，但仍存在一些不足。例如：由于試驗要求分階段進行，因此比較耗時[12]；只適用于評價那些染毒后動物在48 h內出現毒性癥狀并死亡的化學物質的急性毒性，若某受試物估計其染毒的動物發生延遲死亡，則不適用；無法像傳統方法那樣提供劑量-效應曲線的數據；雖然有效減少了試驗動物的死亡數量，但仍然以死亡作為觀察的終點，終究要付出動物生命的代價。但有專家預測，由于上下法與不以死亡為觀察終點的固定劑量法相比，出現毒性反應的概率接近，因此具有發展為不以死亡為終點的方法的潛力。

目前對農藥的安全性評價的主要手段還是動物毒性試驗，1995年在東京召開的國際標準實驗規范(GLP)協調會議就提出動物毒性試驗不測LD50也可以，主要盡可能用少量動物獲得更多的急性毒性信息。急性毒性代替方法的建立與應用，能夠大量減少試驗中所用的動物數量，減少樣品消耗，節約試驗資源，降低開發成本，保護動物權益[13]。在我國改進經典的LD50測定法也是勢在必行。

[參考文獻]

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