全自動微生物定量分析儀在食品檢測中的應用

于曉婕，孫秋影，李蓉娟，陳曉東，李雪梅，施東福，于杰，*

（1.四川大學生命科學學院，四川成都 610065；2.國家農獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點實驗室，遼寧東港 118300；3.遼寧丹東出入境檢驗檢疫局，遼寧丹東 118000）

全自動微生物定量分析儀在食品檢測中的應用

于曉婕1，孫秋影2，李蓉娟2，陳曉東3，李雪梅2，施東福2，于杰2，*

（1.四川大學生命科學學院，四川成都 610065；2.國家農獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點實驗室，遼寧東港 118300；3.遼寧丹東出入境檢驗檢疫局，遼寧丹東 118000）

摘 要：微生物污染引起的食源性疾病是世界食品安全最突出的問題之一，采取有效方法對食品微生物進行檢測是非常必要的。主要對全自動微生物定量檢測方法與傳統的檢測方法進行比對分析，并采用這兩種方法對海產品及烘干雞肉進行微生物檢測，結果表明全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測的準確性和敏感性均較高，但也有其局限性。

關鍵詞：微生物檢測；食品安全；全自動微生物定量分析儀（TEMPO）

食品是人類賴以生存和發展的物質基礎，近幾年來，安全問題越來越受到人們的重視，微生物對食品的污染問題也相應的受到人們的關注。微生物在生產、運輸、銷售等各個環節都有可能污染食品，一旦污染，便會大量繁殖，導致食品腐敗變質，引起食源性污染和食物中毒。而現在環境污染和生態破壞日益加劇，可導致人類感染和中毒的致病菌種類也越來越多。為了防止此類中毒事件的發生，采取適當有效的食品微生物檢測方法，是避免和預防微生物食源性污染的重要手段。而傳統的檢測方法實驗繁雜、耗時較長、工作繁重[1-2]。因此，人們開始研究食品微生物檢驗的新途徑，尋找微生物檢測的新載體，全自動微生物定量分析儀（TEMPO）就是在這種新思路下而產生的新型微生物檢測儀，它是在建立MPN方法[3-5]的基礎上，以16管的形式改良成一個單獨的耗材、最小化的卡片，利用發生特應的酶反應檢測相應的熒光信號來判讀微生物的指標。

當前，現代科學技術蓬勃發展，而微生物檢測技術也融合了生理學、生化學、免疫學、分子生物學和電子技術等多種學科[6]，不斷創造檢測的新方法，尋找新思路。傳統的微生物檢測需要大量的器皿、長時間的實驗前準備工作和試驗后消毒工作[7]，操作復雜，耗費時間長，而全自動微生物定量分析儀（TEMPO）操作簡便易行，特定的試劑無需大量人力，批量操作省時省力。本文以海產品及烘干雞肉的微生物檢測為例，分別從菌落總數計數、大腸菌群計數、大腸桿菌計數、金黃色葡萄球菌計數以及腸桿菌科計數等檢測項目上，對比國標方法與TEMPO，以此評價全自動微生物定量分析儀（TEMPO）的的優勢和不足。

1 材料

1.1 樣品

海產品及烘干雞肉（寵物食品）：由國家農獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點實驗室樣品收樣室提供。

1.2 儀器及試劑

全自動微生物檢測儀以及相應所使用的檢測卡片與試劑由法國梅里埃公司生產；傳統檢驗所用的培養基以及各種試劑均由OXOID公司所生產。各種試劑以及培養基均在有效期內使用。

2 檢測方法與結果

2.1 菌落總數檢測

菌落計數是用來監督產品的衛生質量并能提示產品是否新鮮或者已腐敗的一項重要指標。同一樣品進行取樣、稀釋、然后分別按照國標GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[8]和全自動微生物自動分析儀（TEMPO）進行檢測。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）對菌落總數的檢測方法和NF EN ISO 4833[9]標準相當的性能水平。它是將樣本接種到培養基，再通過TEMPO充填器傳輸到有3種不同規格的48孔卡片中。同時充填器也會密封卡片以此避免在隨后的處理過程中帶來的污染的風險。將國標法所做的平板連同卡片一同在培養箱內培養，卡片中存在的微生物分解培養基中的底物，并產生能被TEMPO讀數器檢測到的熒光信號。48 h后分別讀取平板菌落數和卡片菌落數。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）是依照MPN方法的原理，TEMPO系統根據陽性孔的大小和數目來推算出原始樣本中的微生物總數。共檢測432份水產品樣品，通過與國標比對，其和平板計數的符合率為89%，對其不符合的樣品進行多次重復的檢測與分析研究，結果發現這些不符合樣品全是酶活力較強的水生軟體動物，這些酶活力較強的物品會影響底物的反應，從而導致全自動微生物定量分析儀（TEMPO）讀取的熒光信號變化，試驗中還發現高酶活可以降低對底物的這種影響。而同組其它樣品檢驗效果均一致，由此而知，全自動微生物定量分析儀（TEMPO）可以用做批量菌落檢測但是有其局限性。

2.2 大腸菌群計數檢測

大腸菌群計數在食品質量監測方面十分有效。陽性結果可能預示著食品加工過程中或加工環境存在著問題。432份樣品進行全自動微生物定量分析儀（TEMPO）和國標法GB 4789.3-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[10]檢測。TEMPO的大腸菌群計數檢測有TC和CC兩種方法，操作方法同樣但是分別有兩種不同的培養基試劑。TEMPO TC的開發是為了獲得NF ISO 4832[11]標準相當性能水平。TEMPO CC法是TEMPO儀器上根據BAM[12]方法專門用于24 h計數食品中大腸菌群的方法。該方法是為了獲得和AOACR官方方法966.24及美國公共健康聯合會檢測乳制品標準方法（SMEDP）一致的效果[13]。卡片由3套不同大小的16孔組成（小，中，大），每種類型孔的容量相差一個對數。培養基中含能發出被TEMPO讀數器檢測到信號的中性熒光底物。培養期間，如果卡片中存在大腸菌群則分解營養底物，pH下降，熒光信號減弱。依照MPN方法的原理，TEMPO系統根據陽性孔的大小和數目來推算出原始樣本中的大腸菌群數。樣品同時進行國家標準檢測，432份樣品通過其和傳統的國標法檢測結果進行對比，符合率為99%。說明全自動微生物定量分析儀（TEMPO）能夠滿足本實驗室大腸菌群的檢測，但由于本實驗室樣品局限性，可能并不能充分說明該法的使用范圍及其影響因素，有待進一步研究。

2.3 大腸桿菌技術檢測

大腸桿菌是人和動物的共同寄居菌。該種細菌大量繁殖可能會造成食物中毒。某些菌種被認為是致病性的并能產生一種或更多種的毒素。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）所配套的試劑EC是專門用于24 h檢測計數大腸桿菌的。該方法達到與ISO 16649-2：2001《食品和動物飼料的微生物學例舉葡萄糖苷酸酶陽性大腸桿菌計數方法，第二部分：44℃溫度下利用5溴-4氯-3吲哚-D-葡糖苷酸的菌落計數技術》[14]標準相當性能水平。培養期間，有大腸桿菌存在的卡片就會還原培養基中的底物并產生可被TEMPO讀數器檢測到的熒光信號。參照MPN方法，TEMPO系統根據陽性孔的數目和大小來推算出原始樣本中的大腸桿菌數量。樣品同時按照國家標準GB/T 4789.38-2008《食品衛生微生物學檢驗大腸桿菌計數》[15]檢測，兩者結果進行對比，符合率為86%，準確度無差異并對不符合的樣品經行多次重復檢測，通過分析顯示該法可以滿足實驗室批量檢測的需要，但是對與高酶活性的樣品不可適用，尤其是高酶活性的水生軟體動物，并通過多次重復試驗發現擴大稀釋倍數可以降低高酶活的干擾。

2.4 金黃色葡萄球菌計數檢測

金黃色葡萄球菌能夠引起細菌性食物中毒，其對水產品的污染將嚴重影響到食品安全和水產品加工出口貿易。TEMPPO-STA是利用凝固酶的原理通過熒光值的判讀來進行葡萄球菌的計數。崔巖，田卓等[16]利用TEMPO/STA法與PetrifilmTM測試片法兩種方法對535個出口水產品進行了檢測比較，結果發現兩法一致性較好（符合率96.6%，準確度無差異）。本文通過國標GB 4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》[17]檢測與TEMPPOSTA的檢測進行比較，結果其符合率達到97%，準確度無差異，而TEMPO/STA法又具有操作簡便，人為誤差小的特點，故其將成為重要的檢測手段。

2.5 腸桿菌科技術檢測

腸桿菌科的細菌是食品工業的主要指標，因為其同時包括腸道致病菌和重要的食物腐敗因子，因此被廣泛地作為食品衛生和安全的指標。本實驗室檢驗腸桿菌科的樣品主要為烘干雞肉（寵物食品）。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）腸桿菌科檢驗所采用的卡片用于22 h～27 h（35±1）°C計數樣品中腸桿菌的卡片，從而判斷是否受污染。該卡片的開發是為了獲得和EN ISO 21528-2標準相當的效果[18]。同樣按照行標SN/T 0738-1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》[19]進行檢測，兩者結果對比，其符合度達到97%，準確度無差異。該法可以用做本實驗室的批量試驗要求，但由于其樣品的局限性對其他樣品的準確性不能確定，有待進一步研究。

3 討論

全自動微生物定量分析儀（TEMPO）與國標方法相比，能夠滿足準確性的要求，省去了傳統試驗方法中繁瑣而耗時的檢測步驟，對于批量檢測更為輕松[20]，實驗過后的滅菌以及清理工作也變得非常簡單。隨著科技的進步，機器自動化代替手工是全世界各行業的一個趨勢[21]，TEMPO方法是食品行業中第一個用于食品和環境樣品的質量指標生物計數的自動化質量指標測試系統。自動化指標測試使得食品制造商只需有限的時間和資源用于技術條件不能檢測的陽性測試樣本的后續試驗。指標測試通常尋找微生物，這些微生物是反映嚴重病原體存在的重要指標。相比那些非常耗時的細菌培養和平板計數讀取，TEMPO通過自動化加快了這一耗時的過程，同時提供優質而一致的實驗結果，并省去通過主觀方式平板讀數的過程，同時保持了樣品從準備到最終報告完成的結果的可追溯性。

通過兩種方法的比對分析我們不難發現，一些高酶活性樣品以及顏色較重的樣品均對結果產生影響。這說明TEMPO全自動微生物定量分析儀（TEMPO）的有一些局限性。一般情況下，高酶活性的樣品會對細菌總數檢測和大腸桿菌計數檢測產生干擾，通過大量的實驗證明，擴大稀釋度，可以減弱這種干擾，但是卻不能消除。通常含有發酵劑的食品、面粉、蛋糕、生面團、容易受到含有強抑制劑（例如香料、高鹽分產品）或者深色產品（可可粉）等樣品用TEMPO檢測時候會受到干擾。

隨著現代科技的發展，可以預料在不遠的將來，傳統的微生物檢測技術將漸被各種新型簡便的微生物快速診斷技術所取代。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）具有廣闊的前景。目前TEMPO檢測的項目還比較局限，檢測樣品也有所區別，但是微生物檢測計數一直在不斷發展，不斷在創新，TEMPO將成為未來重要的檢測手段之一，有待于進一步開發利用。相信憑借著TEMPO檢測儀的發展檢測自動化時代即將到來。

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[1]張遠.我國食品安全問題分析及其對策[J].中國食物與營養,2005(9):15-18

[2]吳清平,周艷紅,蔡芷荷.衛生微生物特異性顯色培養基的研究與應用[J].中國衛生檢驗雜志,2005,15(1):124-126

[3]Cochran W G.Estimation of bacterial densities by means of the“Most Probable Number”[J].Biometrics 6,1950,6(2):105-116

[4]Woodward R L.How probable is the most probable number[J].Am Water Works Assoc,1957,49:1060-1068

[5]沈飚,汪云泉,徐君輝.MPN原理的TEMPO儀檢測食品中大腸菌群檢測數據評定[J].檢驗檢疫學刊,2009,19(3):39-40

[6]閆雪,姚衛蓉,錢和.國內外食品微生物快速檢測技術應用進展[J].食品科學,2005,26(6):269-272

[7]丁筠.食品微生物快速檢測系統的研究[D].長春:吉林大學,2007

[8]中華人民共和國衛生部.GB 4789.2-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京:中華人民共和國衛生部,2010:1-7

[9]International Organization for Standardization.Standard NF EN ISO 7932-2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of microorganisms-Colony-count technique at 30 °C[S].Australia:International Organization for Standardization,2007:1-13

[10]中華人民共和國衛生部.GB 4789.3-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數[S].北京:中國標準出版社,2010:1-10

[11]International Organization for Standardization.Standard NF ISO 4832-2006 Microbiology-General guidance for the enumeration of coliforms.Colony-count technique[S].Australia:International Organization for Standardization,2009:1-8

[12]Feng P,Stephen D,Weagant S D,et al.Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria[J].Bacteriological Analytical Manual,2002,8:102-135

[13]International Organization for Standardization.International Standard ISO 16649-2 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of β-glucuronidase-positive Escherichia coli.Part 2:Colony-count technique at 44℃using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide[S].Australia:International Organization for Standardization,2007:1-13

[14]Wehr H Michael,Joseph F Frank.Standard methods for the examination of dairy products[M].America:American Public Health Association,2004:80-82

[15]中華人民共和國衛生部.GB/T 4789.38-2008食品衛生微生物學檢驗大腸桿菌計數[S].北京:中國標準出版社,2010:1-15

[16]崔巖,田卓,沈葆真,等.TEMPO/STA法在水產品金黃色葡萄球菌計數檢測中的應用[J].微生物通報,2010,37(8):1243-1246

[17]中華人民共和國衛生部.GB 4789.10-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗[S].北京:中國標準出版社,2010:1-18

[18]International Standard EN ISO 21528-2 (2004)-Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae.Part 2:Colony-count method[S].Australia:International Organization for Standardization,2007:1-10

[19]中華人民共和國國家進出口商品檢驗局.SN/T 0738-1997出口食品中腸桿菌科檢驗方法[S].北京:中國標準出版社,1997:1-10

[20]楊小龍,陳朝瓊.食品微生物快速檢測技術研究進展[J].河北農業科學,2008,12(12):51-53

[21]孫顯,李玉峰.食品微生物檢測技術[J].生命科學儀器,2009,7(5):25-28

The Automatic Microorganism Quantitative Analyzer Apply in Test of Food Microorganism

YU Xiao-jie1，SUN Qiu-ying2，LI Rong-juan2，CHEN Xiao-dong3，LI Xue-mei2，SHI Dong-fu2，YU Jie2，*
（1.College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，Sichuan，China；2.National Key Laboratory of Pesticid and Veterinary Drug Residue and Marine biotonix Detection，Donggang 118300，Liaoning，China；3.Dan dong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dandong 118000，Liaoning，China）

Abstract：Foodborne disease caused by Microbial pollution is one of the most outstanding issues of the world's food safety，take effective methods for food microorganism detection is necessary.This paper introduced the difference of the automatic microbiological quantitative detection method and the traditional detection method，and the use of two methods on seafood and dried chicken to test microorganisms，the results showed that automatic microorganism quantitative analyzer（TEMPO）test accuracy and sensitivity was higher，but it had its limitations.

Key words：the test of microorganisms；food safety；the automatic microorganism quantitative analyzer（TEMPO）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.001

國家質檢總局科研項目（2008IK001）

于曉婕（1991—），女（漢），學士，主要從事微生物研究。

于杰（1963—），男（漢），學士，主要從事食品微生物檢驗工作。

2012-10-10