水生生物谷胱甘肽相關酶對持久性有毒物質響應機理的研究

李紹娟 王一梟 趙歡 周一兵

工農業生產的快速發展、城鎮建設規模的日益擴大，以及溢油等突發事故和災害等的發生，導致大量持久性有毒物質排入水體中，使水環境受到了空前的污染。持久性有毒物質包括持久性有機污染物和重金屬，由于其生物積累性、高毒性等特征，對水生生物具有明顯的毒性效應［1］，干擾生物的生理功能［2，3］，導致組織發生障礙甚至器官損傷［4］。生物體利用一系列解毒代謝相關蛋白對持久性有毒物質進行生物轉化，降低其對機體的損傷，維持機體正常生理活動及代謝平衡。環境污染會引起生物體內解毒代謝相關蛋白的變化，探討生物體內解毒代謝相關蛋白的變化成為近年來環境污染監測的重要指標之一。

持久性有毒物質進入機體后，會與機體解毒代謝酶結合進行生物轉化，谷胱甘肽-S-轉移酶（gluthione S-transferase，GST）是重要的Ⅱ相解毒酶類，可以催化谷胱甘肽硫基與Ⅰ相代謝產物結合，增加其疏水性，形成共軛化合物經過細胞膜上的ATP泵泵出胞外，從而達到解毒的目的［5］。解毒過程會大量產生氧自由基，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）具有清除脂質過氧化物、過氧化氫，減輕有機氫過氧化物的功能，可以減少機體解毒過程中產生的活性氧自由基，防止細胞膜等生物組織受到氧化損傷［6］。谷胱甘肽S轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶在持久性有毒物質生物代謝中的重要作用引起學者的廣泛關注。

1 谷胱甘肽硫轉移酶（GST）對環境污染脅迫的響應

1.1 谷胱甘肽硫轉移酶（GST）對持久性有機污染物脅迫的響應

尹大強等［7］對林丹和溴氰菊酯類單獨作用下鉤蝦（Gammarus puler L.）體內谷胱甘肽轉硫酶GST活性變化進行研究發現，林丹暴露24h后GST活性明顯上升，48h后，林丹和溴氰菊酯誘導的鉤蝦GST活性均明顯升高。Brain等［8］發現，多氯聯苯誘導會影響圓蛤（Mercenariamercenaria）GST活性，誘導后圓蛤的GST活性是原來的5倍。有機污染物脅迫會對水生生物產生損傷，機體通過生物轉化降低有機污染物對機體的毒性效應，GST作為II相解毒酶，其GST活性隨污染物脅迫發生改變，但機體不同組織解毒功效不同，因此GST分布及性質也存在不同。Isaac等［9］研究了非洲沼蝦（Macrobrachium vollenhovenii）不同組織中GST的性質，試驗表明非洲沼蝦的所有組織中都含有GST，并且在肝臟中的活性最高，肌肉中的活性最低。用苯并芘和芘對梭魚（Mugilso-iuy）進行誘導試驗發現［10］，其肝臟GST呈現誘導效應。Bianchini等［11］在對張口蟹（Chasmagnathus granulatus）進行甲基對硫磷注射后發現其肝胰臟內GST活性明顯增加。Sayeed等［12］在用溴氰菊酯誘導月鱧（Channa punctatus）時發現48h后，其肝臟和腎臟中GST活性升高，而鰓中的活性逐漸衰退，分析認為肝和腎臟中GST活性的升高與GSH活性的升高有關。不同水生生物肝臟GST活性都呈現最高，充分表明肝臟是機體重要的解毒器官，其解毒效能與有機污染物生物轉化密切相關。

Nunes等［13］的研究發現，氯苯氧異丁酸會引起鹵蟲（Artemia parthenogenetica）體內GST的顯著抑制。丁秀蓉等［14］發現，低濃度壬基酚誘導牙鲆（Paralichthys olivaceus）GST活性升高，而高濃度壬基酚誘導則抑制GST活性。穆景利等［15］用苯并芘對黑鯛（Sparusmacrocephalus）進行誘導試驗時發現，不同濃度下其肝臟內GST活性均呈現先增高后降低的趨勢。李傳慧等［16］在研究原油對半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）幼魚肝臟GST活性的影響時發現，除低濃度外，其他濃度誘導時GST活性也呈現了先上升后下降的趨勢。由此可見，低濃度有機污染物誘導會引起機體產生大量解毒代謝酶，增強機體解毒能力，促使有機污染物快速代謝；高濃度有機污染物對機體的毒性效應已超過機體解毒酶的代謝速率，因此導致大分子酶類受到損傷，酶活性呈現抑制趨勢。

1.2 谷胱甘肽硫轉移酶（GST）對重金屬污染脅迫的響應

環境中的重金屬污染往往以游離重金屬離子的形式發揮毒性，重金屬污染脅迫亦會影響水生生物GST酶活性的變化。Lopes等［17］研究表明銅礦廢水污染水域的淡水魚類肝臟GST活性高于清潔水域。Paris等［18］的研究也發現，斑馬魚（Danio rerio）暴露在40、140μg/L銅離子中其肝臟GST活性顯著增加。Elumalai［19］研究暴露于不同濃度鋅、汞中青蟹（Carcinusmaenas）GST活性變化時發現，在肝臟、肌肉和眼中其活性增加?？梢?，GST活性的變化趨勢與環境污染情況密切相關，機體GST活性的變化可以用于反映環境中重金屬含量的變化。

2 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）對環境污染脅迫的響應

2.1 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）對持久性有機污染物脅迫的響應

Livingstone等［20］發現歐洲黃蓋鰈（Limanda limanda）暴露于含有多環芳烴的沉積物中80d后，GPx活性比對照降低。張景飛等［21］的研究證明在2，4-DCP的脅迫下，鯽魚（Carassius auratus）谷胱甘肽過氧化物酶（Se-GPx）的活性先被抑制后被誘導。Padey等［22］報道了硫丹降低了月鱧（Channa punnctatus）的 GPx活性。Vijayavel等［23］研究發現，鋸緣青蟹（Scylla serrata）暴露在萘中，其肝、血淋巴和卵巢GPx活性降低。但是李傳慧等［16］在研究原油對半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）幼魚肝臟GPx活性的影響時發現，GPx變化趨勢與GST相似，出現先增加后降低的趨勢；梁仕杰等［24］在用苯酚誘導紅鯽時發現，其肝臟內GPx活性與有機污染物苯酚之間存在劑量時間依賴效應。有機污染物脅迫下谷胱甘肽過氧化物酶在不同生物中出現的不同變化趨勢，分析原因可能與其誘導濃度和時間有關。另外，由于不同生物對于有機污染物的耐受能力存在差異，在有機污染物脅迫下，氧自由基的產生量不同，產生氧化損傷的程度亦存在差別，因此酶活性表現出不同的變化趨勢。

2.2 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）對重金屬污染脅迫的響應

王凡等［25］研究牙鲆肌肉中的GPx活性時發現，低濃度的Cu2+即會對其活性產生誘導作用，而高濃度Cu2+則會對GPx活性產生抑制作用。鄧思平等［26］研究鎘對尖紫蛤（Sanguinolaria acuta）抗氧化酶活性證明，在0.05mg/L濃度下，谷胱甘肽過氧化物酶在鰓和消化盲囊中都呈現明顯的時間劑量依賴關系，在0.5mg/L濃度下，24h、72h活性并不上升，120h時有所下降，消化盲囊中活性在24h迅速升高，然后逐漸下降。不同生物谷胱甘肽過氧化物酶在高濃度重金屬污染脅迫下表現出抑制的現象，可能是由于重金屬在機體內與某些生物大分子形成金屬絡合物，從而導致酶失活或使其生理功能受到抑制，對于這一現象的機理還需要深入探討。

3 谷胱甘肽酶類對環境污染物脅迫的分子響應機制

谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的變化與這兩種酶基因轉錄水平調控的變化密切相關，隨著分子生物學研究的日益廣泛，關于谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化物酶對污染脅迫響應機理的研究也已深入到分子水平。

目前已經克隆獲得了鰱魚（Hypophthalmichthysmolitrix）和鳙魚（Aristichthys nobilis）等淡水魚類［27］、日本對蝦（Penaeusmonodon）［28］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［29］、花斑溪（Rivulusmarmoratus）［30］等多種水生生物谷胱甘肽硫轉移酶（GST）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）［31］的基因全長序列。Rhee等［32］克隆并分析了琥珀刺沙蠶（Neanthes succinea）中的Ω 型GST 基因發現，經氯化銅（CuCl2）誘導后，該基因的表達量顯著上升。Hoarau等［33］通過半定量RT-PCR 研究了有機污染物苯并芘（BaP）和重金屬鎘（Cd）對紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）的GST-π 基因表達的影響，結果表明用BaP（100μg/L）單一處理，紫貽貝消化腺中的GST-π 基因表達量很低，但是僅用 Cd（200μg/L）處理，或用 Cd（200μg/L）+ BaP（100μg/L）進行聯合處理會導致該基因的表達量顯著提高。劉振興等［34］對日本鰻鱺（Anguilla japonica）的兩種谷胱甘肽過氧化物酶進行了克隆，并分析了在不同組織中GPX的表達差異。研究發現，鰻鱺的腸、肌肉和肝臟等組織中GPx1和GPx4基因明顯表達，并且GPx1表達量明顯高于GPx4。以上研究可以看出在持久性有毒物質脅迫條件下水生生物體內GST基因也存在被誘導的趨勢，這與這兩種酶在持久性有毒物質誘導條件下的變化趨勢基本一致。谷胱甘肽酶類分子生物學的深入研究為利用谷胱甘肽酶類相關基因作為環境監測的分子生物標記奠定了理論基礎，隨著相關研究的不斷深入，研究相關基因表達調控機理，闡述相關酶類代謝及解毒的分子機制成為下一步的研究方向。

4 展望

由于谷胱甘肽類酶在生物體解毒代謝過程中的重要作用，在環境問題日益受到關注的今天，關于生物體谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶在環境污染下響應機理的研究日益增多，大量研究報道不同污染物脅迫下這兩種酶的變化特征，但是不同動物間酶活變化趨勢存在差別，即使是相同物種，但由于試驗誘導濃度、時間和條件的不同，酶活變化也存在差異，因此很難進行比較和分析。若想以這兩種谷胱甘肽酶作為早期環境污染監測的生物標志物需要進行進一步深入細致的研究，對于不同物種確定適當的酶活測定方法。

機體對持久性有毒物質的生物轉化是一系列酶共同作用的結果，谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶活性的變化也與其他解毒代謝酶活性的變化存在關聯性，在確定持久性有毒物質對水生生物這兩種酶活性影響的基礎上，結合其他解毒代謝酶對環境污染的響應研究，確定不同酶在解毒代謝過程中的相互作用可以綜合性地對環境污染進行評價，進而實現早期污染的診斷。

谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶活性的變化從蛋白水平反應了機體對持久性有毒物質的響應，然而蛋白水平的變化與基因表達調控密切相關。目前關于水生生物谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶基因已陸續報道，這為逐步開展持久性有毒物質脅迫下谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶基因表達調控的研究，分析功能基因的表達特征提供了基礎。功能基因表達變化與基因上游轉錄因子的調控密切相關，深入探討解毒代謝調控通路，研究機體抗氧化防御的細胞信號轉導系統是了解功能基因表達變化特征的基礎，然而谷胱甘肽相關酶這方面的報道甚少。因此進一步開展谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽過氧化酶基因表達特征與持久性有毒物質效應關系之間的研究，為快速監測環境污染提供了有效的途徑，亦為了解機體解毒代謝調控的信號轉導系統奠定了理論依據。

［1］ Di Giulio RT, Washburn PC, Wenning RJ, et al.Biochemical responses in aquatic animals：A review of deteiminants of oxidative stress［J］.Environ Toxicol and Chem, 1989, 8：1103-1123.

［2］ 劉福軍, 張飲江, 王明學.銅對魚類慢性毒性研究進展［J］.水生生物學報, 2003, 27（3）：302-307.

［3］ Wright DA, Welbourn PM.Cadmium in the aquatic environment：a review of ecological, physiological, and toxicological effects on biota［J］.Environ Rev, 1994, 2：187-214.

［4］ Jones I, Kille P, Sweeney G.Cadmium delays growthhormone expression during rainbow trout development［J］.J Fish Biol,2001, 59：1015-1022.

［5］ Mathews CK, van Holde KE.Integration and control ofmetabolic proceses［M］//Biochemistry, 1sted.New York：The Benjamin/Cummings Puhlishing, 1990：711.

［6］ 金芬芬, 徐團, 秦圣娟, 等.鎘對長江華溪蟹肝胰腺線粒體抗氧化酶活力和脂質過氧化水平的影響［J］.水生生物學報, 2011,35（6）：1019-1024.

［7］ 尹大強, 金洪鈞, 于紅霞, 等.鉤蝦膽堿酯酶（ChE）和谷胱甘肽轉硫酶（GST）的敏感性和特異性比較研究［J］.應用生態學報 , 2001, 12（4）：615-618.

［8］ Brian NB, Singh BR.Induction of glutathione-S-transferase in the Northern quahog Mercenariamercenaria after exposure to the polychlorinated biphenyl（PCB）mixture aroclor 1248［J］.J Pro Chem,2002, 21（8）：489-494.

［9］ Isaac OA, Adeyinka A.Organ distribution and kinetics of glutathione transferase from African river prawn, Macrobrachium vollenhovenii（Herklots）［J］.Aquat Toxicol, 2005, 71（2）：193-202.

［10］ 王重剛, 陳奕欣, 鄭微云, 等.苯并（α）芘、芘及其混合物暴露對梭魚肝臟谷胱甘肽硫轉移酶活性的影響［J］.海洋科學,2004, 28（3）：40-43.

［11］ Bianchini A, Monserrat JM.Effects ofmethyl parathion on Chasmagnathus granulatushepatopancreas：Protective role of sesamol［J］.Ecotox Environ Safe, 2007, 67（1）：100-108.

［12］ Sayeed I, Parvez S, Pandey S, et al.Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater, Channa punctatus Bloch［J］.Ecotox Environ Safe, 2003, 56：95-301.

［13］ Nunes B, Carvalho F, Guilhermino L.Effects of widely used pharmaceuticals and a detergent on oxidative stress biomarkers of the crustacean Artemia parthenogenetica［J］.Chemosphere, 2006, 62（4）：581-594.

［14］ 丁秀蓉, 李正炎, 王波, 等.壬基酚對牙鲆肝臟EROD和GST酶活性的影響［J］.中國海洋大學學報, 2007, 37（增刊）：101-104.

［15］ 穆景利, 王新紅, 林建清, 等.苯并［a］芘對黑鯛肝臟GST活性的影響及其與肝臟代謝和但脂代謝產物之間的變化關系［J］.生態毒理學報 , 2009, 4（4）：516-523.

［16］ 李傳慧, 夏斌, 陳碧鵑, 等.勝利原油對半滑舌鰨幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽硫轉移酶活性的影響［J］.海洋環境科學, 2011, 30（6）：827-830.

［17］ Lopes PA, Pinheiro T, Santos MC, et al.Response of antioxidant enzymes in freshwater fish populations（Leuciscus alburnoides complex）to inorganic pollutants exposure［J］.Science of the Total Environment, 2001, 280（1/3）：153-163.

［18］ Paris-Palacios S, Biagianti-Risbourg S, Vernet G.Biochemical and（ultra）structuralhepatic perturbations of Brachydanio rerio（Teleostei, Cyprinidae）exposed to two sublethal concentrations of copper sulfate［J］.Aquat Toxicol, 2000, 50（1-2）：109-124.

［19］ Elumalai M, Antunes C, Guilhermino L.Enzymatic biomarkers in the crab Carcinusmaenas from the Minho River estuary（NW Portugal）exposed to zinc andmercury［J］.Chemosphere, 2007,66（7）：1249-1255.

［20］ Livingstone DR, Archibald S, Chipman JK, et al.Antioxidant enzymes in liver of the dab（Limanda limanda）from the North Sea［J］.Mar Lcol Prog Ser, 1992, 91（1-3）：97-104.

［21］ 張景飛, 王曉蓉, 沈驊.低濃度2, 4-DCP對鯽魚肝臟抗氧化防御系統的影響［J］.中國環境科學, 2003, 23（5）：531-534.

［22］ Padey S, Ahmad I, Parvez S, et al.Effect of endosulfan on antioxidants of freshwater fish Channa punctatus Bloch：1.Protection against lipid peroxidation in liver by copper preexposure［J］.Arch Environ Contam Toxicol, 2001, 41：345-352.

［23］ Vijayavel K, Gomathi RD, Durgabhavani K, et al.Sublethal effect of naphthalene on lipid peroxidation and antioxidant status in the ediblemarine crab Scylla serrata［J］.Marine Pollution Bulletin,2004, 48（5-6）：429-433.

［24］ 梁仕杰, 高麗君, 董先輝, 等.苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD和GSH-Px活性的影響［J］.基礎醫學, 2012, 2（7）：31-36.

［25］ 王凡, 趙元鳳, 劉長發.Cu2+對牙鲆肌肉抗氧化防御系統的影響［J］.淡水漁業 , 2007, 37（2）：27-29.

［26］ 鄧思平, 趙云濤, 朱春華, 等.鎘對尖紫蛤抗氧化酶活性及脂質過氧化的影響［J］.水生生物學報, 2012, 36（4）：659-695.

［27］ 廖婉琴, 梁旭方, 王琳, 等.淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的克?。跩］.生態科學, 2005, 24（1）：6-8.

［28］ 吳文林, 戴聰杰, 袁建軍.日本對蝦Rab基因的克隆、結構分析與重組表達［J］.泉州師范學院學報：自然科學, 2007, 25（2）：102-107.

［29］ 胡永樂, 梁旭方, 林群, 等 .斜帶石斑魚alpha型與rho型GST基因cDNA全序列的克隆與分析［J］.生態毒理學報, 2008,3（3）：250-255.

［30］ Lee YM, Seo JS, Jung SO, et al.Molecular cloning and characterization of θ-class glutathione S-transferase（GST-T）from thehermaphroditic fish Rivulusmarmoratus and biochemical comparisons with α-class glutathione S-transferase（GST-A）［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 346：1053-1061.

［31］ 何珊, 梁旭方, 廖婉琴, 等.鰱魚、鳙魚、草魚、谷胱甘肽過氧化物酶cDNA的克隆及肝組織表達［J］.動物學雜志,2007, 42（3）：40-47.

［32］ Rhee JS, Lee YM, Hwang DS, et al.Molecular cloning and characterization of omega class glutathione S-transferase（GST-O）from the polychaete Neanthes succinea：Biochemical comparison with theta class glutathione S -transferase（GST-T）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 2007, 146：471-477.

［33］ Hoarau P, Damiens G, Roméo M, et al.Cloning and expression of a GST-pi gene in Mytilus galloprovincialis.Attempt to use the GST-pi transcript as a biomarker of pollution［J］.Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 2006, 143：196-203.

［34］ 劉振興, 柯浩, 曹艷林, 等.日本鰻鱺谷胱甘肽過氧化物酶1和4的克隆、分析和組織表達分布［J］.中國水產科學,2010, 17（3）：439-447.