激光誘導納秒時間分辨熒光法原位測定吸附于紅樹葉片表面的菲

摘要[HTSS]實現吸附于植物葉片表面多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）的現場原位測定，是該研究領域的發展方向之一。本實驗利用激光誘導納秒時間分辨熒光（Laserinduced nanosecond timeresolved fluorescence， LITRF）系統，建立了原位測定吸附于秋茄（Kandelia obovata， Ko）、木欖（Bruguiera gymnorhiza， Bg）和桐花樹（Aegiceras corniculatum， Ac）3種紅樹葉片表面菲（Phenanthrene， Phe）的新方法。本方法測定吸附于Ko、Bg和Ac葉片表面Phe的線性范圍分別為2-1400 ng/spot， 1-1000 ng/spot和4-2000 ng/spot，檢測限分別為0.20， 0.14和0.42 ng/spot，加標回收率為89.6%-108.1%， 78.2%-92.4%和93.2%-112.9%，且方法的相對標準偏差小于6.0%（n=9）。將方法用于實驗室暴露樣品的原位測定，并與光纖熒光法對比，其靈敏度、線性范圍改善顯著，更有利于實現植物葉片上PAHs的現場原位測定。

[KH*3/4D][HTH]關鍵詞[HTSS]激光誘導納秒時間分辨熒光； 原位； 紅樹葉片； 菲

[HK][FQ（32，X，DY-W][CD15]20130409收稿；20130522接受

本文系國家自然科學基金（Nos.21075102， 21177102），廈門大學基礎創新科研基金， 中央高校基本科研業務費專項資金（No.CXB2011036）和國家基礎科學人才培養基金（No.J1030415）資助項目

Email： yzhang@xmu.edu.cn

1引言

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）是環境中廣泛分布的一類持久性有機污染物，可通過大氣傳輸在區域內甚至在全球范圍內分布，并可在大氣、水體、土壤和植物等多種介質間進行交換^[1-3]，其中植物葉片是該類污染物富集和傳輸的重要場所^[4，5]。紅樹林生態系統具有特殊生態功能，對鄰近的海岸帶區域、特別是河口地區污染物的去除作用顯著^[6-10]。目前，有關紅樹林濕地中PAHs的研究多限于分析其在濕地沉積物中的種類、含量、來源和林地內微生物對其降解作用等^[11-13]，直接研究吸附于紅樹葉片上的PAHs卻少見報道^[14-16]。

植物葉片中PAHs的傳統測定方法^[17-20]雖然選擇性好、靈敏度高，但樣品往往需要較復雜的前處理步驟，費時、費力，消耗大量有機溶劑，易造成二次污染。更重要的是，破壞性的提取方式難以保存植物中PAHs的原始賦存形態，所得結果無法指示PAHs在樣品中的時空分布。在文獻[14，15]基礎上，光纖熒光法^[16]實現了紅樹葉片表面PAHs的原位檢測，但在實現現場原位檢測方面，該方法的檢測限、檢測范圍有待進一步改善。

基于已有工作^[14-16]，以菲（Phenanthrene， Phe）為PAHs代表物質，新鮮的紅樹葉片為基質，利用激光誘導納秒時間分辨熒光（Laser induced nanosecond timeresolved fluorescence， LITRF）系統，建立檢測限更低、靈敏度和檢測范圍更佳的原位測定吸附于3種紅樹葉片表面Phe的方法。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

LITRF系統（德國哥廷根激光實驗室），儀器條件參數為： Timing start： 75 ns， Timing shift： 1 ns， Lambda excitation： 266 nm， Laser energy： 40 μJ， Time slice： 40， Channels： 674， Cooler temperature：

Symbolm@@ 7 ℃；Cary Eclipse熒光分光光度計（美國Varian公司）。5 μL平口微量進樣器（上海醫療激光儀器廠），5 mL移液管（上海申立玻璃儀器有限公司）。 Phe （純度>99%，美國Aldrich公司）；丙酮（分析純， 廣東西隴化工股份有限公司）；二氯甲烷（分析純， 上海國藥集團化學試劑有限公司）。

Phe儲備液：稱取0.1000 g Phe， 用丙酮溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配成1.00 g/L儲備液，儲于4 ℃冰箱中備用。實驗時采用逐級稀釋法配制Phe工作液。

樣品準備：于漳州龍海紅樹林保護區（東經：117°29′-118°14′；北緯：24°11′-24°36′；海拔：0 m）采集秋茄（Kandelia obovata， Ko）、木欖（Bruguiera gymnorhiza， Bg）、桐花樹（Aegiceras corniculatum， Ac）3種紅樹胚軸，沙培種植12個月。摘取成熟度相近的平整葉片用于實驗。

2.2實驗方法

選取3片外觀相近的葉片，按文獻[16]所述實驗方法，在葉片標定位置點加系列濃度的Phe丙酮溶液，保持LITRF系統光纖探頭稍觸及葉片表面，測定葉片前、中、后3個位置上吸附Phe的熒光強度，取平均值。

2.3實驗室暴露樣品的測定

將8 mg Phe溶于5 mL丙酮，均勻噴于1 L試劑瓶內壁，待丙酮揮發完全后，懸掛放入Ko， Bg， Ac葉片各3片，蓋子密閉，葉片在其中暴露4 h。取出后立刻用LITRF法測定葉片表面Phe的濃度cL；葉片用3×10 mL CH2Cl2超聲提取3 min，合并提取液，濃縮至10.0 mL，靜置至溶液澄清，用熒光分光光度法測定溶液中Phe的濃度，據葉表面積換算為葉片表面Phe的濃度cF。

3結果與討論

3.1吸附于紅樹葉片表面Phe的熒光發射光譜

在266 nm激發波長下，掃描了吸附于Ko， Bg和Ac紅樹葉片表面Phe的熒光發射光譜， 圖1和圖2分別為吸附于Ko和Bg葉片表面Phe的熒光發射光譜圖，吸附于Ac葉片表面Phe的光譜性質與Ko相似，故未列出。由兩圖可得，Ko和Bg葉片背景熒光均較弱，不影響其表面Phe的測定。吸附于Ko和Bg葉片表面Phe的最大發射波長分別為369和368 nm，即相比Bg，吸附于Ko葉片表面Phe的最大發射波長發生1 nm紅移，且同濃度Phe在Ko葉片表面的熒光強度高于Bg葉片表面的，該實驗結果應由Ko葉表層蠟質的極性強于Bg所致^[21]。

[TS（]圖1吸附在秋茄葉片表面Phe的熒光發射光譜

Fig.1Emission spectra of phenanthrene （Phe） adsorbed on Kandelia obovata （Ko） leaves

λex = 266 nm； λem max = 369 nm. 0： 葉片背景（Blank）； 1-7： 100， 300， 500， 700， 900， 1100， 1300 ng/spot Phe.[HT5][TS）]

[TS（]圖2吸附在木欖葉片表面Phe的熒光發射光譜

Fig.2Emission spectra of Phe adsorbed on Bruguiera gymnorhiza （Bg） leaves

λex = 266 nm； λem max = 368 nm. 0： 葉片背景（Blank）； 1-5： 200， 400， 600， 800， 1000 ng/spot Phe.[HT5][TS）]

作為吸附介質的葉片是否具有較低的熒光背景，以及吸附于其表面的PAHs是否具有較強的熒光信號，是建立原位測定方法應考慮的關鍵因素，而本研究所涉及Ko， Bg和Ac紅樹植物的葉片較好地滿足以上要求，這為建立LITRF法以實現原位測定吸附于其表面的Phe提供了條件。

3.2工作曲線、線性范圍及檢出限

為實現定量測定吸附于3種紅樹葉片表面的Phe，配制了系列濃度的Phe丙酮溶液，按照2.2節所述實驗方法測定了吸附在3種紅樹葉片表面不同濃度Phe的相對熒光強度。由圖1可見，隨吸附于Ko葉片表面Phe濃度的增加，熒光強度呈線性增加，Bg和Ac的規律與Ko相似。結果表明，在一定濃度范圍內，吸附于3種紅樹葉片表面Phe與其相對熒光信號強度呈良好的線性3.3回收率實驗

在測定的3種紅樹葉片表面Phe的線性范圍內選擇一個濃度（c1），加在葉片正面，測其相對熒光信號強度IF1，代入其回歸方程算出Phe的初始測定濃度c1′；然后在原點樣處添加一定量的Phe（200 ng/spot），記該點Phe的總加入量為c2，測其熒光信號強度IF2，計算出總測定濃度c2′，根據公式R%=（c2′-c1′）/（c2-c1） × 100%分別求其回收率（表2）。由表2可知，吸附于3種紅樹葉片表面Phe的回收率為78.2%-112.9%，這表明所建方法的準確度可滿足實驗要求。

所示，相對標準偏差（RSD）均小于6.0%，表明方法具有良好的重復性和精密度。

3.5實驗室暴露樣品的測定結果

如表4所示，在被Phe污染的空氣中暴露4 h后，利用LITRF法測得3種紅樹葉片表面Phe的平均濃度分別為Ko： 151.90 ng/spot， Bg： 103.56 ng/spot， Ac： 68.18 ng/spot，略高于以超聲提取^[22]常規熒光法測定的結果。由于本實驗中LITRF法僅測定了葉片正面Phe濃度作為葉片表面Phe濃度，而常規熒光法所測為葉片正背面Phe的平均濃度，故兩種方法測定結果存在差異，主要由葉片正、背面不同的吸附能力所致。已有研究表明，植物葉片吸附PAHs的能力與其表層蠟質含量密切相關，即蠟質含量越高，其吸附PAHs容量越大^[23]。Ko， Bg和Ac紅樹葉片正面蠟質含量均高于背面^[24]，故其正面Phe的吸附量高于背面。然而，兩方法測定結果的相對誤差在10.00%以內，表明新建LITRF法可用于直接測定吸附于3種紅樹葉片表面的Phe，且結果準確可靠。此外，常規熒光法以葉片整體為研究對象，無法獲取PAHs在葉片不同位置的分布情況，新建LITRF法彌補了該方面的不足，為原位研究賦存于植物葉片表面不同位置PAHs的環境行為提供了新方法。

4結論

利用LITRF系統建立了原位快速測定吸附于紅樹葉片表面PAHs的方法。已知光纖熒光法的檢測限為1.64-5.02 ng/spot^[16]，而本LITRF法為0.14-0.42 ng/spot，其靈敏度提高了近12倍，且線性范圍更寬，在現場原位測定植物葉片樣品中PAHs含量、評估PAHs區域污染狀況、考察PAHs在環境介質間交換行為等方面具有潛在應用價值。此外，實際環境中PAHs大多以多組分混合物形式存在，LITRF系統的時間分辨功能可為多組分同時測定提供技術支持，具有實現現場原位檢測多組分PAHs的潛力。

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