檸檬酸水溶液生物親和萃取高效液相色譜法檢測魚肉樣品中喹諾酮類藥物殘留

[HT][HK40][HT5”H]摘要[HTSS]用瑞利散射光譜法研究了魚血清蛋白在不同濃度有機弱酸水溶液中的變性情況，并結合液相色譜法討論了魚肉樣品中主要基體蛋白質與魚油對喹諾酮類藥物（QNs）殘留提取的影響。研究表明， 0.5 mol/L檸檬酸水溶液可引起蛋白質緩慢且完全變性，導致蛋白質與QNs絡合物離解，釋放結合的藥物。本研究以檸檬酸水溶液為生物親和提取液，發展了一種高效樣品前處理方法，結合高效液相色譜法測定了魚肉中QNs殘留。樣品前處理過程為：稱取適量勻漿后的魚肉樣品于聚四氟乙烯管中，以0.5 mol/L檸檬酸水溶液提取QNs殘留2次，分別取2 mL提取液加入PSA和Cleanert NH2 混合顆粒吸附劑進行凈化。本方法用于測定魚肉樣品中的依諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星和加替沙星，回收率為82.0%～95.2%，RSD為1.9%～5.8%，檢出限為0.0055～0.016 mg/kg。方法步驟簡單、快速、可靠、環境友好。

1引言

喹諾酮類藥物（Quinolones，QNs） 是一類人工合成的抗菌藥，其中最為常見的是依諾沙星（Enoxacin，ENX），諾氟沙星（Norfloxacin，NOR），環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），洛美沙星（Lomefloxacin，LOM），恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）和加替沙星（Gatifloxacin，GAT）等。QNs具有低廉的價格和良好的廣譜抗菌性，被廣泛應用于水產養殖。然而，QNs在水產品中的過量殘留會引起食用者腸道菌群失衡，甚至癌變，從而威脅人類健康^[1]。世界食品法典委員會和世界各國對水產品中QNs殘留均有嚴格的限量要求，國際貿易中也對其限量有嚴格規定。因此，QNs的殘留檢測尤為重要。

水產品中含有大量蛋白質、脂肪等復雜基體，因此，水產品中QNs殘留檢測的關鍵是樣品前處理。目前，有關動物組織樣品中QNs殘留檢測的樣品前處理方法報道較多^[2～7]，所涉及的方法主要為藥物殘留提取、固相萃取（SPE）凈化兩個步驟，提取液一般為可以沉淀蛋白質的乙腈與酸（包括三氯乙酸、鹽酸、甲酸等）混合溶液。這些方法的缺點是耗用大量的有機溶劑， 樣品前處理步驟多， 提取液凈化復雜，極易造成殘留藥物的損失。Stubbings

等以乙腈為提取液，以固相分散萃取（DSPE）技術簡化了樣品凈化步驟，但仍然需要使用乙腈作為溶劑^[8]。

本課題組在研究水產品中農藥殘留檢測的前處理方法中，發現蛋白質基體與藥物的結合作用影響水產品中藥物殘留的提取效率^[9～11]。已有研究表明，QNs與蛋白質有較強的結合作用^[12，13]，這會降低QNs殘留的萃取效率。傳統提取方法中乙腈與酸的混合液作為提取液時，蛋白質發生快速沉淀，引起藥物包裹損失。弱酸水溶液也可以使蛋白質發生變性、沉淀，但作為QNs殘留提取劑尚未見文獻報道。本研究選擇合適濃度的檸檬酸水溶液作為QNs殘留提取劑，使蛋白質完全變性，離解與其結合的藥物，以期提高QNs殘留提取效率，建立了一種簡單、快速、高效和環保無污染的水產品樣品前處理方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計（美國Varian公司）；1100液相色譜儀（美國安捷倫公司）； JJ2（200361）組織搗碎勻漿機（常州國華電器有限公司）。

ENX， NOR，CIP，LOM，ENR和GAT標準品（純度 92.0%～97.0%，中國藥品生物制品檢定所）；魚血清白蛋白（FSA，煙臺大學生命科學學院提供），制備方法見文獻[14]；PSA（N丙基乙二胺修飾的硅膠）粉末、Cleanert NH2 SPE（氨基修飾的硅膠）粉末（天津博納艾杰爾公司）；草酸、檸檬酸、三氯乙酸（優級純）和乙腈、甲酸（色譜純）均為天津科密歐試劑公司產品。鯉魚樣品購于當地市場。

標準溶液的配制：ENX， NOR，CIP，LOM，ENR和GAT用1.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L HCl溶液配制成1000 mg/L的單標和混合標準儲備溶液。

2.2色譜條件

液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫25℃；流動相為乙腈2%甲酸（15∶85， V/V）；流速為0.5 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量20 μL。

2.3樣品前處理

準確稱取2.0 g勻漿后的樣品（鯉魚脊背肉）于20 mL聚四氟乙烯管中，加入10.0 mL 0.5 mol/L檸檬酸溶液，振蕩，渦旋1 min，靜置30 min。待沉淀完全后取上清液于20 mL聚四氟乙烯管中，殘渣用5.0 mL 0.5 mol/L檸檬酸水溶液再次提取，兩次提取液合并后取2 mL上清液， 加入20 mg PSA，渦旋，離心（6000 r/min）5 min，取上清液過0.45 μm濾膜后，供HPLC分析。

分 析 化 學第41卷

第10期李桂芝等： 檸檬酸水溶液生物親和萃取高效液相色譜法檢測魚肉樣品中喹諾酮類藥物殘留

3結果與討論

3.1蛋白質對提取QNs回收率的影響

QNs與BSA（牛血清白蛋白）、FSA具有較強結合作用，結合常數大于104 mol/L^[12～14]。為討論提取QNs時，蛋白質、魚油對回收率的影響，做如下實驗： 取6個20 mL聚四氟乙烯離心管，編號1～6，分別向1和2管中加入0.5 mL水、向3和4管中加入0.5 mL 1.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L FSA溶液， 向5和6管中加入10 mg魚油；6個離心管中均加入10 μL 1000 mg/L QNs混合標準溶液，放置30 min。以GB/T 203662006^[15]方法，用甲酸乙腈溶液作為提取液測定回收率。不同基質時，QNs提取回收率測定結果為：空白樣品81.7%～87.9%； 蛋白質69.31%～73.3%；魚油80.2%～87.2%。提取方法相同時，以FSA為基體的QNs提取回收率明顯低于以水和魚油為基體的回收率，說明QNs與FSA（模擬樣品基體）的結合降低了QNs的提取效率，魚油對QNs的提取率影響較小。因此在測定以蛋白質為主要基體的水產品中QNs殘留時，應考慮蛋白質對萃取效率的影響。 [TS（][HT5”SS]圖1不同弱酸濃度對魚血清蛋白瑞利散射強度的影響

Fig.1Fish serum albumin （FSA） synchronous Rayleigh scattering intensity in different concentration of weak acid

a. 檸檬酸（Citric acid）； b. 草酸（Oxalic acid）； λex=λem=483 nm. CFSA=1.00×10

Symbolm@@ 6 mol/L。[HT5][TS）]

3.2蛋白質變性對QNs提取回收率的影響

3.2.1瑞利散射光譜研究不同濃度弱酸對蛋白質結構的影響當蛋白質濃度較低時，瑞利散射光譜可以反映出蛋白質的變性程度和分子結構變化，故采用共振瑞利散射研究不同濃度弱酸由圖 1 可見，當檸檬酸和草酸這兩種弱酸的濃度達到一定值時，蛋白質開始變性，蛋白質分子內部疏水基團外露，溶解性變小，形成小于散射波長尺度的小顆粒而產生瑞利散射^[16]；當弱酸濃度合適時，形成散射的小顆粒濃度最大，瑞利散射強度也最大。當弱酸濃度進一步增加時，蛋白質變性速度加快，蛋白質之間疏水基團相互聚集形成尺度大于散射波長的大顆粒，引起瑞利散射強度迅速下降；當弱酸濃度過大時，蛋白質產生快速聚集，并最終形成沉淀，不再產生瑞利散射。當弱酸濃度適當時，蛋白質發生緩慢變性，與其結合的藥物可以發生離解作用；如果弱酸的濃度太高則容易產生蛋白質聚集沉淀，對藥物產生包裹作用。因此，在測定蛋白質為基體的樣品中QNs殘留時，可以選擇合適的弱酸濃度實現藥物的高效提取。

[TS（][HT5”SS]圖2不同濃度檸檬酸水溶液對喹諾酮藥物提取回收率的影響

Fig.2Effect of different concentration of citric acid on the recoveries of quinolones

1. 依諾沙星； 2. 諾氟沙星； 3. 環丙沙星； 4. 洛美沙星； 5. 恩諾沙星； 6. 加替沙星。

1. Enoxacin； 2. Norfloxacin； 3. Ciprofloxacin； 4. Lomefloxacin； 5. Enrofloxacin； 6. Gatifloxacin.[HT5][TS）]

3.2.2不同濃度弱酸對實際樣品中喹諾酮藥物提取回收率的影響為了進一步闡明不同濃度弱酸對實際樣品中QNs提取回收率的影響，采用HPLC分析不同濃度草酸和檸檬酸提取液提取QNs時藥物的回收率。分別準確稱取2.0 g魚肉樣品于20 mL聚四氟乙烯管中，加入10 μL 1000 mg/L QNs混合標準溶液，放置30 min，用不同濃度弱酸提取液提取QNs，

計算回收率。結果表明，不同濃度的草酸提取液對魚肉樣品中QNs的提取回收率均低于50%；不同濃度檸檬酸水溶液對魚肉樣品中QNs的提取效率影響見圖2。當檸檬酸濃度在0.1～2.0 mol/L時，提取液對QNs的提取回收率較高。這是因為此時檸檬酸水溶液使蛋白質發生緩慢變性， 釋放了與其結合的藥物。而當檸檬酸水溶液濃度大于2 mol/L時，蛋白質快速變性、凝聚而包裹了藥物，因此回收率偏低。選擇0.5 mol/L檸檬酸作為實際樣品測定提取液。

3.3提取液凈化步驟的改進

由3.1和3.2節可知，蛋白質對QNs殘留的提取影響較大， 0.5 mol/L檸檬酸溶液可有效提取樣品中的QNs。由于提取液為弱酸水溶液，極性較強，因此提取液中的脂溶性雜質較少，可以簡化凈化步驟。實驗表明，PSA和Cleanert NH2的混合顆粒吸附劑可有效去除雜質，而對QNs吸附作用可以忽略。[TS（][HT5”SS]圖3樣品加標（0.5 mg/kg）的高效液相色譜圖

Fig.3Chromatograms of six quinolones obtained by spiked fish sample. Sample spiked at 0.5 mg/kg

1. 依諾沙星； 2. 諾氟沙星； 3. 環丙沙星； 4. 洛美沙星； 5. 恩諾沙星； 6.加替沙星。

1. Enoxacin； 2. Norfloxacin； 3. Ciprofloxacin； 4. Lomefloxacin； 5. Enrofloxacin； 6. Gatifloxacin.[HT5][TS）]

3.4樣品加標測定結果及方法的準確度、檢出限與回收率

準確量取標準貯備液適量，用1.0 mmol/L HCl稀釋成 0.025， 0.10， 0.40和1.6 mg/L的混合標準溶液，供HPLC分析，每個濃度進樣3次，以平均峰面積（y）與相應的標準溶液濃度（x， mg/L）做線性回歸分析，結果見表1。

對魚肉空白樣品進行3個水平（0.25， 0.5和1.0 mg/kg）的加標回收實驗，樣品前處理如2.3節所述，平行測定5次，樣品加標色譜圖見圖3，計算結果見表1。結果表明，在本研究所選實驗條件下，6種QNs 能被很好地萃取與分離， 回收率為82.0%～95.2%， RSD為1.9%～5.8%，根據DL=3S/N計算得出本方法的檢出限為0.0055～0.016 mg/kg。本方法的回收率與精密度均好于國標方法，且樣品前處理步驟少，便于操作。

2.1

3.5實際樣品分析

用活鯉魚進行了環丙沙星喂養實驗，喂養量為每天20 mg/kg，連續喂養4 d，宰殺后取魚肉進行環丙沙星殘留檢測，得到了陽性檢驗結果。

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