高通量便攜式熒光檢測裝置的研制與應用

1引言

熒光分析法由于靈敏度高、選擇性好和操作簡便等優點，在衛生檢驗、環境分析、食品分析、藥物分析、生化與臨床檢驗等領域廣泛應用^[1～7]。高通量、快速熒光檢測系統因能將批量分析速度提高數倍至數十倍^[8～12]，具有重要的經濟和社會意義。商品化的單通道微孔板熒光儀^[13～15]為實現高通量熒光檢測提供了技術支持，具有檢測速度快、靈敏度高、線性范圍寬等優點。多通道熒光激發與檢測相對于單通道熒光激發與檢測具有更高的通量，可成倍提高檢測速度^[16，17]。微孔板的多通道熒光激發一般通過光分束鏡實現激發光源的均分耦合多通道激發光纖傳輸^[16]；多通道發射光的采集通過耦合多通道發射光纖傳輸^[16，17]，檢測或通過多個檢測單元同時檢測^[16]，或通過一個檢測單元順序檢測^[17]得以實現。一般需要較為復雜的光學系統。

本研究對基于商品化一字線激光模組的多通道激發/熒光成像進行了研究，設計了一套結構簡單、小巧輕便、成本低廉，具有多通道特點的高通量便攜式熒光檢測裝置，結合自行研制的圖像處理軟件，實現了溶液的高通量定量檢測。

2實驗部分

2.1裝置的設計與構建

裝置的基本工作原理如圖1所示：一字線激光模組發出線狀激發光，將盛有待測溶液的排狀微孔板置于線狀輻射光路時，溶液受激發而發光，CCD數碼相機采集經濾光片濾去背景光的熒光圖像，圖像經實驗室自行研制的圖像處理軟件處理轉化為熒光強度數據。裝置的主要部件包括激發光源、CCD數碼相機、圖像處理軟件、排狀微孔樣品板。

2.1.1激發光源激發光源采用商品化一字線激光模組。一字線激光模組是通過在激光點光源前安裝一個鮑威爾棱鏡（Powell lens），使激光束通過非球面透鏡轉化為光密度較為均勻、穩定性好、直線性好的一條直線。激光模組的波長分布從紫外到紅外波段，通過更換激光光源，可實現對不同激發波長物質的檢測。

2.1.2CCD數碼相機

2.1.3圖像處理軟件圖像處理軟件ChemImageProcessor（CIP）為實驗室自行研制，用于處理和分析熒光圖像。CIP可以加載、顯示熒光圖像，并可以掃描圖像上的每個熒光光斑，計算出每個光斑的總亮度，即熒光強度。

2.1.4排狀微孔樣品板排狀微孔樣品板為12孔/條×8條的白色96孔可拆微孔板（上海精睿公司），一次可進行12通道的同時檢測。以手動更換微孔條更換檢測溶液。也可配以電子機械移動實現自動化。

2.2化學試劑羅丹明B（RB）、氯金酸（HAuCl·4H2O）、檸檬酸三鈉與硼砂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；鄰巰基苯甲酸（TSA，98%）與2，6吡啶二羧酸（PDCA，99%），購自百靈威公司；Hg單元素溶液標準物質（中國計量科學研究院）；實驗用水為MilliQ（18 MΩ·cm）超純水。鄰巰基苯甲酸修飾納米金（TSA@Au）的合成方法參考文獻[18]。

2.3裝置性能測試

以RB作為測試溶液，對裝置的穩定性、精密度和靈敏度等主要性能參數進行評價。RB的激發和發射波長分別為λex=552 nm， λem=572 nm。激發光源選用M532UL5一字線激光模組（20 mW，532 nm，西安銘輝公司），發射光濾光片選用560 nm長波通濾光片（深圳激埃特公司）。

2.4水溶液中Hg2+濃度檢測

在排狀微孔樣品板上依次加入一定濃度的TSA@Au和RB，不同濃度的Hg2+，用5 mmol/L pH 8.0硼砂緩沖液稀釋至300 μL，超聲混合均勻后，用本研究構建的高通量便攜式熒光檢測裝置對其熒光強度進行測定。

2.5自來水和湖水樣品中Hg2+濃度的加標回收實驗

本實驗室自來水龍頭打開5 min后，采集自來水樣。湖水樣采自于廈門大學芙蓉湖表層湖水。水樣分別經由0.22 μm的過濾膜過濾后， 存儲于4 ℃的冰箱中待用。分別平行取3份145 μL自來水樣或湖水樣，在其中分別加入5 μL Hg2+標準溶液，Hg2+加標濃度分別為60、120和240 μg/L，按2.4節（稀釋2倍）方法檢測熒光強度。

3結果與討論

3.1裝置的特點

目前，商品化和文獻報道的微孔板熒光儀的光路系統較為復雜，并且需要專業的精密調節^[13～17]。本高通量便攜式熒光檢測裝置具有如下特點：（1）易于搭建整套裝置的光路系統簡單，可方便快捷地搭建；（2）便攜整套裝置選用小型化器件組裝，小巧輕便。整套裝置的尺寸為225 mm×225 mm×230 mm， 重量約1 kg，便于攜帶，適用于現場快速檢測；（3）成本低廉整套裝置的成本約3000元；（4）多通道一字線激光模組是線狀光源，輻照寬度與光源距樣品的距離有關。樣品距光源越遠，激光線越長，輻照寬度越寬，但相應的單孔光源強度減弱。同時檢測的樣品數可通過調節光源與樣品的距離確定。相對于現有的微孔板熒光儀每增加一個檢測通道，都要相應增加光學元件和檢測器相比，更為簡單靈活；（5）檢測速度快對96孔微孔板樣品的檢測與數據處理可在10 min內完成。

3.2裝置性能評價

3.2.1光源強度分布及光源校正在排狀樣品微孔條上的12個微孔池中分別加入300 μL 3×10

Symbolm@@ 8 mol/L RB溶液， 以一字線激光模組線狀激光光源激發，以此考察各微孔池接收到的一字線激光模組線狀激光強度的差異性。[TS（][HT5”SS]圖212孔樣品微孔3.3裝置的應用性能評價

3.3.1水溶液中Hg2+檢測為了評價裝置的可應用性，本研究發展了基于Hg2+誘導TSA@AuRB能量轉移熒光強度檢測的新方法。在pH 8.0的硼砂溶液介質中，TSA@Au金膠因表面帶負電荷而與呈陽離子狀態的RB通過靜電作用形成熒光共振能量轉移復合物^[18]。以RB的最大激發波長激發RB時，因TSA@Au的作用，RB作為能量給體熒光被猝滅。當體系中存在微量Hg2+時，Hg2+可誘導帶負電的TSA@Au發生螯合作用團聚而釋放出RB，從而調節TSA@AuRB復合物的能量轉移效率，觀察到體系的熒光強度對Hg2+濃度呈正相關響應。在溶液中加入PDCA配體可增強體系對Hg2+的選擇性。

實驗結果表明， 本裝置具有結構簡單、小巧輕便、成本低廉，多通道與檢測速度快的特點。由于所選用的一字線激光模組輻照到各樣品微孔池上的光源強度存在差異，因此以RB水溶液作為光量子計對光源強度進行歸一化校正。本裝置有望用于大批量樣品的現場快速檢測。現有的裝置是通過手動更換微孔條更換檢測溶液，若采用電子機械設備實現樣品微孔板的移動，可進一步提高檢測速度。

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