毛細管區帶電泳高效分離和高靈敏檢測α乳清蛋白和β乳球蛋白

1引言

乳糖制品廣泛用于食品及醫藥行業，如嬰兒食品、人造奶油及糖果制品等。藥用乳糖在醫藥行業的應用也日益增多，目前普遍作為藥用填充劑或稀釋劑用于藥物生產中。然而，由于乳糖一般從牛奶乳清中提取，常因含有乳清蛋白等雜質而使其純度降低。這些雜質蛋白的存在使得用藥過敏的可能性大大增加，在注射用藥中尤為突出。2010版《中國藥典》特別增訂了對乳糖有關檢測的法定標準[5989811]，主要目的是保證藥用乳糖中由雜質蛋白引起的過敏反應最小化。由此可見，在制藥行業中的乳糖制品安全已經得以充分重視，而在食品行業亦如此。

本研究涉及的α乳清蛋白和β乳球蛋白是乳糖制品中的主要雜質，也是主要過敏原。因此，嚴格控制乳糖制品中二者的含量極為重要。本研究組的前期實驗表明，高效液相色譜（HPLC）對二者的分離并不理想，且因紫外檢測器的檢測限較高而難以真正用于乳糖制品質量控制。目前為止，以HPLC技術對乳清成份的分析往往耗時較長^[1，2]。而其它傳統分析方法，如凝膠電泳法^[3]及免疫法^[4]等，均在方法成本、操作簡單性或靈敏度方面不太理想。因此，發展一種靈敏、快速、高效的α乳清蛋白和β乳球蛋白分離檢測方法十分必要。

近年來，毛細管電泳（CE）在大分子分離分析領域展現了獨特的優勢，其在生物領域及食品、藥物質量控制領域中的應用也日益廣泛^[5，6]。目前使用CE技術進行蛋白分離的最主要問題之一是樣品吸附等原因造成的分離性能和檢測靈敏度下降^[7]。解決這一問題的手段主要包括采用涂層毛細管^[8，9]、使用極端pH條件、發展高靈敏度的檢測方法以及樣品的富集等。其中，高靈敏度檢測方法主要有電化學檢測、熒光檢測和質譜（MS）檢測方法，而樣品富集技術一般可分為柱前富集和柱上富集^[10～12]。通常使用紫外（UV）檢測器可達到μmol/L量級的檢出限^[13]。而采用樣品富集和激光誘導熒光（LIF）檢測結合的方法，可使檢測限降低至pmol/L～nmol/L水平^{[7，10，11，14]}。在實際應用中，因UV檢測方法簡單、儀器普及率高、性能穩定、自動化程度高等優點而廣泛使用。目前，蛋白質的高靈敏度檢測多采用UV方法，如對牛血清白蛋白（BSA） 檢出限可達到30 pmol/L^[15]、通過柱前濃縮可實現的對肌紅蛋白的1700倍富集^[16]等，但這些方法所使用的樣品處理步驟都較為復雜。采用簡便快速的CE方法對α乳清蛋白和β乳球蛋白進行痕量分離檢測至今未見報道。

本研究采用毛細管區帶電泳（CZE）實現了對α乳清蛋白和β乳球蛋白的高效分離及高靈敏檢測。通過使用優化的樣品處理步驟及實驗條件，有效避免了兩種蛋白在毛細管內壁的吸附問題，二者峰形良好，在2 min內可實現基線分離。將本方法用于兩種蛋白測定，線性范圍和重現性均能滿足要求。該方法已用于實際樣品的分析，可成功區分經過一次精制的乳糖粗品和二次精制的乳糖制品，可望在乳糖制品雜蛋白檢測領域得到更廣泛的應用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Aglient3D HPCE毛細管電泳儀 （美國安捷倫科技公司），儀器控制、數據采集與處理由安捷倫化學工作站軟件 ChemStation（版本B.01.03）完成；熔融石英毛細管（50 μm I.D. × 38.5 cm，有效長度30 cm，河北鑫諾公司）；萬分之一分析天平 （日本島津公司）；雷磁pHS3C型精密pH計 （上海精密科學儀器有限公司）。

α乳清蛋白和β乳球蛋（中國食品藥品檢定研究院提供），乳糖制品（供注射用，重慶藥友制藥有限公司提供）。甲醇、乙腈及異丙醇（色譜純，美國Dima公司）。其它試劑均為國產分析純，所有溶液均以去離子水配制，并在使用前經0.45 μm的纖維素濾膜過濾。

2.2電泳條件

新毛細管在使用前用1 mol/L NaOH沖洗10 min，H2O 沖洗5 min，背景緩沖溶液沖洗4 min； 每兩次運行之間用1 mol/L NaOH沖洗3 min，H2O 沖洗1 min，背景緩沖溶液沖洗4 min， 以保證重現性。每4次進樣后更換緩沖液。儀器運行條件為：電壓+30 kV，毛細管溫度25 ℃， 紫外檢測波長205 nm，壓力進樣5 kPa

2.3樣品制備

精確稱取適量α乳清蛋白和β乳球蛋標準品，溶于水，即為標準樣品溶液。乳糖制品處理方法如下：稱取0.500 g樣品，溶于1.00 mL水，渦旋混勻后，超聲20 min（超聲溫度不超過25 ℃），2000 × g離心1 min，取上清液進行分析，進樣前樣品于4 ℃保存。

3結果與討論

3.1CZE條件的優化

蛋白質大分子在毛細管內壁上的吸附問題一直是制約CE在生物大分子領域應用的主要瓶頸問題。有關測量乳品中蛋白質的報道通常只用毛細管內壁涂層的方法對蛋白吸附進行抑制，如孟序等^[17]曾使用聚丙烯酰胺和聚丙烯醇涂層毛細管對乳品中的6種蛋白進行分離分析，但其背景緩沖溶液成分相對復雜，并需對蛋白質進行變性處理。本研究采用CE模式中分析速度快、消耗低、體系最簡單的CZE模式，利用未涂層的熔融石英毛細管、簡單的背景電解質及簡單的樣品處理方法對乳糖制品中的α乳清蛋白和β乳球蛋白進行分析。

對兩種等電點相近、清疏水性質相近、而空間結構及蛋白表面所含活性基團略有不同的蛋白大分子的分離而言，在首先解決蛋白在毛細管內壁的吸附的前提下，還需調整合適的背景電解質體系，使得二者遷移時間的差別足以保證基線分離。實驗條件的優化主要集中于對背景電解質成分、濃度及pH值、毛細管長度及內徑、樣品處理方法及進樣方式、分析電壓及溫度等方面。最終通過實驗參數的系統優化，兩種組分在電壓+30 kV，毛細管溫度25 ℃，25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）的條件下，2 min內得到了快速、高效的基線分離，并可達到令人滿意的檢測靈敏度（圖1）。

3.2方法評估

3.3實際樣品測定

在實際乳糖樣品的測定中，采用上文所述樣品處理方法，在高、中、低3種濃度下測定方法回收率，可得二者的加標回收率分別為α乳清蛋白71%、β乳球蛋白50%。經樣品處理后，可定量檢出初次精制的乳糖粗品中這兩種蛋白（圖2），并沒有觀察到樣品基質的干擾，可見方法選擇性及靈敏度均可達到實際檢測的要求。而在二次精制的乳糖成品中，未

4結論

本研究建立了簡單、快速、靈敏、穩定的CZE方法，在不使用涂層毛細管及復雜的背景電解質條件下，2 min內實現了乳糖中的α乳清蛋白和β乳球蛋白的高效分離及高靈敏檢測。與同類方法相比，本方法的靈敏度明顯提高，并能用于實際樣品的分析。樣品處理方法的回收率合理，方法重現性好。本方法由于簡單、靈敏、穩定，可望在乳糖領域乃至其它食品行業有更多應用。

需要指出，本方法并沒有完全抑制β乳球蛋白在毛細管內壁的吸附，以至于該蛋白的檢出限比較高（12 mg/L）。這可能是由于β乳球蛋白表面活性基團與毛細管內壁硅羥基作用較復雜，在該緩沖體系下不能被有效抑制所致。可以預測，如果不追求方法的簡單性，向背景電解質中引入其它合適的添加劑，加之其它實驗參數的合理調整，即可有效抑制β乳球蛋白在毛細管內壁的吸附，改善峰形，進一步降低檢出限。此外，采用毛細管內壁修飾的方法，也可有效避免多種蛋白的管壁吸附，如以羧甲基殼聚糖動態涂敷的方法對毛細管進行適當處理后，亦可實現這兩種蛋白的高靈敏度分離檢測^[9]。這類方法為CZE在食品安全領域的廣泛應用提供新的思路。另一方面，以質譜作為檢測器也更加豐富了CE的分析效率，提供更多的結構信息及更高的靈敏度^[18]。但是，目前CEMS聯用技術仍在穩定性和儀器接口的成熟度上尚待改進。

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