副溶血弧菌的熱激亞致死損傷與顯微紅外光譜檢測

摘要[HTSS]采用傳統的平板計數法作為對照，利用顯微紅外光譜技術（4000-400 cm

Symbolm@@ 1）并結合化學計量學，研究了在55 ℃水浴中熱激處理不同時間（0， 2， 4， 6和8 min）對副溶血弧菌失活和亞致死損傷的作用效果。二維主成分分析（PCA）表明，正常細菌與受損細菌能夠各自聚類，明顯區分，而且損傷程度不同的細菌也能夠基本區分。載荷圖分析（LPA）發現，加熱處理后，副溶血弧菌中的多糖、結構蛋白、脂質、核酸都發生了變化，其細胞壁、細胞膜和DNA皆遭受損傷。類模擬軟獨立建模（SIMCA）的結果表明，一般情況下，受不同程度熱損傷的細菌均有80%以上的預測率，能夠被有效區別開。研究表明，顯微紅外光譜技術具有檢測熱激后亞致死損傷的副溶血弧菌的潛力。

[KH*3/4D][HTH]關鍵詞[HTSS]顯微紅外光譜技術；副溶血弧菌；亞致死；熱激

[HK][FQ（32，X，DY-W][CD15]20121207收稿；20130201接受

本文系國家863項目（No. 2012AA101601）、國家科技支撐計劃項目（No. 2012BAD29B02）、國家自然科學基金項目（No. 31000063）和上海市科委長三角科技聯合攻關項目（No. 11495810600）聯合資助

* Email： xmshi@sjtu.edu.cn

1引言

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水產品中引起食物中毒的重要病原菌之一^[1]，在海產品中的攜帶率高達45.7%，在我國部分沿海地區，由副溶血弧菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒事件中居首位^[2]。副溶血弧菌對熱較敏感，一般在56 ℃處理5 -10 min即可被殺死。經加熱、冷凍、脫水等處理后，細菌或被殺死，或無損存活下來，還有一些可能受到了亞致死性損傷^[3]。在適當條件下，受損細菌可以修復損傷并恢復包括毒力和繁殖能力在內的所有生理活性，仍然具有致病性，嚴重威脅人類健康。因此，檢測亞致死損傷的副溶血弧菌對于食品安全監控具有重要意義。然而，用傳統的平板方法檢測受損細菌工作量大，檢測周期長^[4]，往往需耗費3-5 d或更長的時間。

紅外光譜技術在微生物檢測中的應用興起于20世紀90年代，具有操作簡單、分析速度快、成本低、應用范圍廣等優點。紅外光譜能夠提供整個有機體的指紋圖譜，反映細胞的生化組成。紅外光譜技術在微生物分類與鑒定、生物膜的研究、抗生素的研究等方面都得到廣泛應用^[5]。2004年，Lin等將其應用于細菌亞致死損傷的檢測^[6，7]。然而，目前大多文獻都采用普通紅外技術，尚未見利用紅外光譜技術研究副溶血弧菌亞致死損傷的報道。

本研究采用顯微紅外光譜技術研究副溶血弧菌的亞致死損傷，其靈敏度更高，制樣更簡單，檢測時間更短。結合化學計量學分析，采用主成分分析（PCA）鑒別區分不同程度損傷的細菌，并用類模擬軟獨立建模（SIMCA）驗證PCA模型的有效性；同時，采用傳統的平板計數法進行驗證；用LPA找出細菌受損后發生改變的組成和結構，探討細菌受損機制。本研究建立了快速有效的檢測亞致死損傷副溶血弧菌的方法，同時探討了食品加工過程中細菌細胞化學組成的變化和細菌滅活的機制，為改進現有的殺菌方法和技術提供理論基礎。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

Nicolet iN10 MX顯微紅外光譜儀（ThermoFisher，USA，帶液氮冷卻的MCT檢測器）。

非選擇性培養基：含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、含3% NaCl的胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）；選擇性培養基：硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽汁鹽蔗糖（TCBS）瓊脂；生理鹽水（0.9% NaCl）；最大修復稀釋液（0.1% 蛋白胨水）。

2.2供試菌株與熱處理培養液的制備

副溶血弧菌ATCC 17802（中國普通微生物菌種保藏管理中心）保存于

Symbolm@@ 80 ℃冰箱中，用40 mL胰蛋白胨大豆肉湯活化，37 ℃ 下175 r/min過夜振蕩培養至穩定期；再將少量菌液涂布于TCBS平板，37 ℃ 培養16 h；挑取單菌落，接種于200 mL 胰蛋白胨大豆肉湯中，37 ℃ 下175 r/min過夜振蕩培養至穩定期。各取10 mL 菌液分別加入15個50 mL 離心管中，4000 r/min 離心4 min 收集菌體。為消除代謝產物和培養基對細菌紅外譜圖的影響，將細胞用10 mL 無菌生理鹽水重復洗滌兩次后，重新懸浮于5 mL 生理鹽水中，制得熱處理培養液。

2.3熱激實驗

將1個熱處理培養液作為空白對照，另外4個裝有5 mL 熱處理培養液的離心管同時浸入55 ℃水浴，彼此保有一定空間以利于熱傳導，分別于2， 4， 6和8 min 后取出，并立即置于冰浴上冷卻至少5 min。每個熱激處理重復3次。在不同培養基上測定存活率，在1 h 內完成活細胞的測定。

2.4損傷細胞在不同培養基上存活率的測定

取0.1 mL 熱激后的菌液加入0.9 mL 的0.1% 蛋白胨水中，經10倍梯度稀釋后，各取10 μL 涂布于TSB和TCBS平板上；涂布后的平板在37 ℃下培養，8 h后開始陸續對各培養基上的菌落形成單位（CFU）進行計數。每個平板計數皆做3次平行，每個熱激處理亦重復3次，計算3次實驗共9個結果的平均值和標準偏差。并以logCFU為縱坐標，加熱時間為橫坐標，繪制細菌存活曲線。

2.5光譜分析

熱激后的菌液同時進行紅外測定。將4.9 mL剩余的菌液離心，倒掉生理鹽水收集菌體，重新懸浮于50 μL 生理鹽水中。取10 μL 菌液滴在BaF2片上，在干燥器中放置約0.5 h，待水分蒸干后，上機測試。顯微鏡放大倍數為150倍；空白BaF2片作背景；掃描范圍：4000-600 cm

Symbolm@@ 1；采集時間：3 s，即16張干涉圖加和；分辨率：8 cm

Symbolm@@ 1；通過面掃描（Map View）模式，每個樣品采集8張圖譜，步長為100 μm×100 μm， 光闌為100 μm×100 μm。每個處理共有24張圖譜。

2.6數據處理與化學計量學分析

用OMNIC Picta軟件（Thermo Fisher， USA）將原始map文件轉換成8張紅外譜圖，再用OMNIC 8.2軟件（Thermo Fisher， USA）進行預處理：選取4000-800 cm

Symbolm@@ 1譜圖進行大氣背景抑制、自動基線校正、歸一化（使酰胺譜帶Ⅰ的吸收強度皆等于1）等處理。因靈敏度較高，無需進行平滑操作。再采用SavitzkyGolay 模式（7Point， polynomial degree 3）將譜圖轉換成二階導數譜圖。紅外譜圖提供的信息較復雜，一般需要結合化學計量學分析。二階導數譜圖分別用SIMCAP 11.5軟件包（Umetrics， Ume， Sweden）進行主成分分析（PCA）和載荷圖分析（LPA），用MATLAB 7.12.0軟件包（The Math Works， Inc.， USA）進行類模擬軟獨立建模（SIMCA）。

PCA是一種無監督的模式識別方法，其目的就是將多維數據壓縮成幾個主要、獨立的潛在變量， 即主成分（PC），以消除眾多信息中相互重疊的部分，這些主成分保存了最相關和最具代表性的信息；PCA的得分圖可以方便地對不同類別進行判定，將不同受損狀態的細菌區分開^[8]。基于PCA的載荷圖分析（LPA）可在一定程度上反映引起聚類的相關化學成分，可幫助尋找關鍵變量，即能夠將不同狀態細菌區分開的那些特定生物化學組成^[9]。SIMCA方法則是一種有監督的模式識別方法，有兩個主要步驟，第一步先建立每一類的主成分分析模型，第二步分別將未知樣品與各類模型進行擬合，以確定未知樣品的類別^[10]。SIMCA方法可檢驗PCA模型的有效性。

3結果與討論

3.1平板計數法檢測熱激后亞致死損傷的副溶血弧菌

圖1是55 ℃熱激處理不同時間后，副溶血弧菌在非選擇性TSB培養基和選擇性TCBS培養基上的存活曲線，隨著加熱時間延長，兩種培養基上的活菌數目均越來越少；加熱8 min后，非選擇性和選擇性培養基上的活菌數分別減少了約2.5和4個數量級，表明死亡細菌數目增加；在非選擇性培養基上的細菌始終比選擇性培養基上的細菌存活數目多，

隨著加熱時間延長，兩者的差距越來越大；未加熱時，兩者相差約0.3個數量級；加熱8 min后，兩者間的差距已增加至約1.6個數量級。

許多選擇性培養基只能讓正常細菌在其上生長，不能修復受損細菌，從而無法檢出；而非選擇性培養基能讓正常細菌和受損細菌都在其上生長，但無法將二者區分開^[11，12]。同一菌液在兩種培養基上活菌數目的差異即是亞致死細菌的數量^[13]，差異不斷增大，表明更多的細菌進入了亞致死損傷的狀態。

Ⅰ區，3000-2800 cm

Symbolm@@ 1是脂質烷基的振動區，主要由細胞膜脂肪酸CH伸縮振動引起^[15]。Ⅱ區，1800-1500 cm

Symbolm@@ 1主要是蛋白質和多肽的酰胺基團振動區。1655-1637 cm

Symbolm@@ 1處的吸收峰屬于酰胺特征譜帶Ⅰ^[10]，這一譜帶通常是細菌紅外譜圖中最強的譜帶；1550-1520 cm

Symbolm@@ 1處的吸收峰屬于酰胺特征譜帶Ⅱ^[16]。Ⅲ區，1500-1200 cm

Symbolm@@ 1是蛋白質、脂肪酸和帶磷酸基團化合物的混合吸收區。Ⅳ區，1200-800 cm

Symbolm@@ 1是細胞壁多糖的特征吸收區。1100-950 cm

Symbolm@@ 1處的寬峰由細胞壁多糖的CO伸縮振動產生^[17]。900-600 cm

Symbolm@@ 1為指紋區。

不同處理的細菌的原始紅外譜圖幾乎沒有區別，這是由于眾多細胞組分引起譜峰疊加、展寬，使得大部分信息都被隱藏^[8]。將原始紅外譜圖經二階導轉換后一般能夠將重疊的吸收帶分開，找到準確的峰位置，去除基線漂移，更清楚顯示譜位移和強度變化，從而使不同處理后細菌的譜圖差異更明顯^[19]。本研究中，不同處理細菌的二階導數譜圖幾乎重合，差別極細微，需要借助化學計量學分析進行進一步的分析。

3.3熱激后副溶血弧菌的主成分分析（PCA）

PCA分析的最終結果是用圖形直觀的顯示多維數據集中樣本的相似或差異^[8]。在PCA圖中，不同處理的樣本各自聚成一組，說明細菌細胞的分子組成發生了變化使得紅外譜圖有顯著差異。提取細菌二階導數譜圖4個特征波段的信息，并分別進行PCA分析，其示意圖見圖3。從圖3可見，4個光譜區域中，未受損細菌都能夠緊密聚成一組，并且與其它加熱處理的細菌明顯區分開。“未受損”和“加熱8 min”是處理的兩個極端，在圖4A-D的4張圖中總是分布在第一個主成分（PC1）的左右兩側； 而“加熱 2 min”、“加熱4 min”和“加熱6 min”處理則是處于過渡區域，說明影響PCA的關鍵在PC1。總之，在圖4中，正常細菌與受損傷細菌能夠清楚、完全地區分開，而受損傷程度不同的細菌也能基本分離。

AlQadiri等研究了在60 ℃水浴中熱激處理不同時間后腸道血清型鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serotype Typhimurium）和單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的亞致死損傷^[7]，其SIMCA結果表明， 兩種細菌不同程度熱損傷的預測率都達到了80%以上，與本研究結果類似。

4結論

顯微紅外光譜技術結合化學計量學分析，可用于熱激后亞致死損傷副溶血弧菌的檢測，并可將不同程度受損的細菌區分開，具有靈敏度高、樣品處理簡單、檢測時間短等優勢；而用傳統的微生物培養方法很可能低估甚至無法檢出亞致死細菌。加熱處理后，副溶血弧菌中的多糖、結構蛋白、脂質、核酸都發生了變化，其細胞壁、細胞膜和DNA皆遭受損傷，這些變化可能是顯微紅外光譜技術檢測亞致死損傷副溶血弧菌的基礎。該技術也可用于驗證加熱處理的有效性，預測細菌的損傷程度，為改進現有的殺菌方法和技術提供理論依據。

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