光電化學競爭法檢測生物素

摘要[HTSS]建立了光電化學系統競爭性檢測生物素（Biotin）小分子濃度的方法。采用聯吡啶釕[Tris（2，2′bipyridine）ruthenium， Rubpy）]作為標記物，以氧化錫納米顆粒為電極，草酸鹽為電子供體還原標記物。在470 nm光激發下，聯吡啶釕的外層電子吸收能量后由基態變為激發態，注入半導體氧化錫納米顆粒電極的導帶，形成光電流信號；草酸鹽還原失去電子的聯吡啶釕使其恢復初始狀態，從而可以再次作為電子供體受激發產生光電流信號。在競爭性檢測生物素（Biotin）濃度時，親和素（Avidin）吸附到氧化錫納米顆粒電極表面作為識別元件，在濃度大于0.5 g/L時能夠達到最大的電極表面覆蓋率。1 μmol/L Rubpybiotin與不同濃度Biotin組成的混合溶液與電極表面的Avidin發生親和反應，光激發后檢測光電流大小；當溶液中Biotin的濃度增加時，致使與電極表面Avidin結合的Rubpybiotin量減少，在光照射下光電流信號降低。這一競爭性光電檢測方法檢測Biotin時，檢出限為8 μg/L。本方法可進一步擴展，應用于有機化合物的競爭性免疫檢測。

1引言

小分子普遍存在于人類生命活動以及所處的環境中。環境中多種持久性有機污染物也是有機小分子化合物，如多環芳香烴、氯代二苯并二惡英、多氯二苯并呋喃以及多氯聯苯等。在諸多常用的檢測小分子化合物的分析方法中，基于抗體識別的免疫檢測方法在速度、通量和成本方面具有顯著的優勢。免疫檢測小分子時，通常會采用競爭性檢測的方式，即將待檢測物標記后與其抗體結合產生可檢測的信號；當加入未標記的待檢測物時，與標記的待檢測物競爭有限的抗體結合位點，導致信號下降^[1]。目前多種標記物和相關的檢測方法與儀器已被開發應用，如放射性同位素、熒光染料、酶、氧化還原分子等。

目前量子產率最高的光電化學電池采用納米TiO2顆粒膜組裝在導電玻璃上，并利用表面吸附的釕吡啶化合物使之敏化^[2]，Kalyanasundaram等^[3]對其它寬帶隙半導體電極和敏化劑也進行了研究。使用敏化劑作為標記分子可以進行生物分子親和反應的檢測，并且光電化學檢測方法理論上應該具有很高的靈敏度；因為在這種方法的激發信號（光）和檢測信號（電流）不會產生相互干擾^[4]。利用Cd量子點（Quantum Dots）^[5] 和納米管^[6，7]進行光電化學傳感已有報道；Pandey等^[8]利用DNA嵌入染料蒽醌作為指示劑光電化學檢測溶液中的DNA，該方法中光激發的蒽醌在溶液中被電子供體還原，利用修飾的石墨碳原子電極可以檢測氧化還原電位的變化。利用蒽醌的光電化學性質也可研究固定于金電極上的雙鏈DNA的電荷傳輸性質，并可以用于疾病的單核苷酸多態性（SNP）分型^[9]。

半導體納米顆粒電極較其它電極在光電化學檢測中具有明顯優勢，可以顯著提高檢測靈敏度，本研究組在檢測溶液中的DNA研究中已經證明^[10]。除利用半導體納米顆粒電極檢測DNA^[11，12]外，還可利用納米顆粒電極非標記檢測了多巴胺（Dopamine）^[13]和ATP^[14]的濃度。關于光電化學檢測生物結合反應已有報道，尤其值得注意的是抗體/抗原的結合反應的光電化學檢測^[15，16]。

聯吡啶釕作為標記物已廣泛用于電化學發光檢測免疫反應^[17，18]，可利用聯吡啶釕合吩嗪（Ru（bpy）2dppz， dppz=dipyrido[3，2a：2′，3′c]phenazine）與dsDNA具有高親和性（K=106-107 L/mol）^[19]的特點檢測金電極表面固定的雙鏈DNA^[20，21]。Zhang 等^[14]采用納米顆粒電極和Ru（bpy）2dppz 檢測了癌細胞中ATP的濃度。

本研究組曾采用染料敏化的光電化學系統定量檢測溶液中的DNA^[10]，該檢測系統包括光電化學標記物Ru（bpy）2dppz，電子供體草酸鹽和電極材料氧化錫納米顆粒。由于該分析系統具有許多高量子產率光電化學太陽能電池的優點，所以在檢測溶液中的DNA時，靈敏度比導體電極、金電極和碳電極有顯著改善。本研究采用光電化學方法競爭性檢測Biotin，Rubpybiotin復合物在此競爭性檢測中作為光電化學標記分子；當各種濃度的Biotin（待檢測物）與1 μmol/L Rubpybiotin混合溶液與電極表面的Avidin反應后，標記分子受激發所產生的光電流會隨Biotin濃度的增加而減小。本方法對Biotin的檢出限為8 μg/L。本研究為采用光電化學方法競爭性檢測小分子的濃度提供了參考。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

雙（聯吡啶）4′甲基4羰基吡啶釕N琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯（Ruthenium bis（2，2′bipyridine）（4methyl4′carboxyl2，2′bi pyridine） NHS ester（RuNHS），美國Fluka公司）；Avidin和Biotin（美國Sigma公司）；Succinimidyl 6（biotinamido）hexanoate（biotinLCNHS，美國Pierce公司）。WLTNSI090銦錫氧化物鍍膜玻璃（涂層（96±4） nm，片電阻（18±2） Ω）， 深圳偉光股份有限公司）。

2.2實驗步驟

2.2.1Rubpy標記avidin和biotinRubpy標記Avidin按文獻[22]方法進行。Rubpybiotin（圖1）的合成：向溶于二甲基甲酰胺（Dimethylformamide， DMF）的RuNHS中加入10倍過量的乙二胺，冰浴中反應1 h；在減壓情況下，去除未反應的乙二胺和DMF；將所得固體溶解在丙酮中，加入乙醚沉淀；沉淀所得固體和biotinLCNHS以摩爾比2∶1溶解在DMF中，室溫反應3 h，Sephadex G25柱分離產物。產物通過NMR， UVVis吸收和循環伏安法表征。[TS（]圖1Rubpybiotin復合物的結構

Fig.1Structure of tris（2，2′bipyridine）ruthenium （Rubpy）biotin conjugate[HT5][TS）]

2.2.2Biotin和Avidin的結合反應氧化錫電極按文獻[22]方法制備。氧化錫電極吸附Avidin 的方法是以25 μL Avidin蛋白溶液覆蓋0.5 cm2 電極表面，靜置30 min；以20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH 7.2）沖洗后，用1%牛血清白蛋白封閉電極，以減少非特異性結合。進行Biotin和Avidin之間的結合反應時，將25 μL Biotin或Rubpybiotin混合液覆蓋在Avidin吸附的電極上，并在無外力混合情況下室溫反應1 h；沖洗后，在電解液中測定光電流。

2.2.3光電流測定光電流測定用CHI800型電化學分析儀，Pt作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極，電極間所加偏壓為+0.3 V；激發光源來自藍色發光二極管（深圳Lamp公司），照明面積為0.2 cm2。在進行光譜測量時， 500 W的氙燈和光柵用于產生單色可變波長的光， 用于激發。

3結果與討論

3.1檢測條件的優化

本研究以Biotin/Avidin為模式系統，研究光電化學方法檢測小分子的可行性。Biotin是一種水溶性維生素（244 Da）。Avidin是蛋清中存在的糖蛋白（66 kDa）。Avidin和Biotin的親和性非常高，解離常數為1015 mol/L。Avidinbiotin系統已被廣泛用于免疫組化、酶聯免疫吸附分析以及分子生物學測定。本實驗將Avidin固定在氧化錫電極表面，使之捕獲溶液中的Biotin或Rubiotin，通過測量Ru標記物產生的光電流測量溶液中Biotin的濃度（圖2）。

Avidin含有堿性氨基酸如賴氨酸和精氨酸，等電點約為10，易于吸附到帶負電荷的電極表面。實驗表明，Avidin對氧化錫電極的吸附性很強，所以采用吸附法在電極上固定Avidin。將電極在各種濃度的AvidinRu中浸泡2 h，沖洗后，通過測量光電流評估蛋白吸附效果。由圖3可見，當AvidinRu濃度從0增加至1 g/L時，光電流先隨溶液中AvidinRu濃度增加而增大；AvidinRu濃度大于0.5 g/L時，光電流達到平臺期，證明在這種濃度下蛋白吸附趨于飽和。表面固定的AvidinRu保持相對穩定，[TS（]圖3吸附在氧化錫電極上的AvidinRu產生的穩態光電流與AvidinRu濃度之間的關系， 小圖：AvidinRu吸附的氧化錫電極浸泡在Ph 7.5，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中（a）0 h（b）2 h后的光電流

Fig.3Steadystate photocurrent of Rulabeled avidin adsorbed on SnO2 electrode as a function of the protein concentration. Inset： Photocurrent of Rulabeled avidin coated SnO2 electrode after soaking in 20 mmol/L phosphate buffer， pH 7.5 for （a） 0 h （b） 2 h

光電流測定采用pH 5.5，10 mmol/L草酸鈉/100 mmol/L磷酸鈉溶液，以470 nm光激發。

為了平衡光電信號和靈敏度的要求，標記物劑濃度選擇1 μmol/L用于競爭性檢測。對照實驗采用吸附牛血清白蛋白（BSA）的電極與1 μmol/L Rubpybiotin反應。它的光電流僅為吸附Avidin電極的1/3，并和未與Rubpybiotin的BSA電極產生的光電流相同，對比證明吸附Avidin電極產生的光電流響應是由于Avidin和Botin之間的特異性相互作用。電極吸附Avidin反應的Rubpybiotin受激發產生光電流時，光電流隨激發光波長的變化情況見圖5。光電流的譜形類似自由標記分子（插圖）的吸收光譜，在470 nm處達到峰值。Avidin/氧化錫電極本身并未表現出波長依存性，證明光激發所產生的光電流是由金屬Ru絡合物引起的。

3.2檢測溶液中biotin的濃度

確定了標記物Rubpybiotin的濃度后，在吸附了avidin的氧化錫電極上競爭性檢測Biotin濃度。檢測時，各種濃度的Biotin與1 μmol/L Rubpybiotin混合，并與吸附了Avidin的本研究組曾采用相同的光電化學檢測系統定量檢測了溶液中DNA的濃度^[10]。在本實驗中。利用標記物競爭性檢測Biotin濃度，檢出為8 μg/L，可與一些酶標記的電化學免疫測定方法相媲美。優化檢測系統和反應條件，如氧化錫薄膜結構、固定方法以及借助外力使溶液混合均勻，還有可能提高檢測靈敏度。本方法可推廣應用到以抗體或受體作為識別元件檢測其它小分子。聯吡啶釕和相關的聯吡啶類化合物的配基可以由多種官能團衍生而來，如羧基和氨基，用于小分子的共價修飾^[18]。與多數免疫分析中的酶標不同，金屬復合物標記體積小且較穩定，適合于苛刻條件下的檢測。

盡管在本研究中以Biotin/avidin模仿競爭性免疫檢測反應，其實在日常生活中僅測定Biotin濃度也是實際需要的。Biotin幾乎存在于所有活細胞中，缺乏會導致多種人類疾病。許多定量測定Biotin的分析方法已被開發應用，包括分光光度法、色譜法及Avidin結合測定法^[23]，而且最近一些Biotin金屬的復合物在Avidinbiotin結合反應的研究中已被合成， 并作為靈敏的熒光指示劑使用^[24]； 大多數測試方法的檢出限為ng或10

Symbolm@@ 7 mol/L^[23]，本方法的靈敏度與這些方法具有可比性。另外，本研究的Biotin/avidin競爭檢測方法可以認為是免疫競爭檢測的模型，只要能夠合成Rubpy標記的小分子和相應的抗體，就能采用相同的方式實現小分子的光電化學免疫競爭檢測。

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