亞臨界1，1，1，2四氟乙烷萃取氣相色譜質譜法測定魚肉中6種性激素殘留

摘要[HTSS]利用亞臨界1，1，1，2四氟乙烷（R134a）萃取技術，建立了魚肉中6種性激素殘留的氣相色譜質譜（GCMS）分析方法。樣品中的藥物經過亞臨界R134a萃取后，先進行冷凍過濾去脂，然后通過C18和NH2固相萃取小柱凈化，最后經七氟丁酸酐衍生后，采用GCMS進行定性與定量分析。本實驗確定了亞臨界R134a萃取6種性激素的最佳條件為：萃取壓力4 MPa，萃取溫度30 ℃，夾帶劑用量6 mL。在此條件下，6種性激素在5-1000 μg/L 濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99；檢出限為0.2-1 μg/kg （S/N=3）。在3種濃度添加水平（1， 5和10 μg/kg）下，6種激素的平均回收率為70.5%-103.6%，相對標準偏差（RSD）為 2.1%-12.5%。采用本方法進行實際樣品檢測時，在一份羅非魚樣品中檢出己烯

1引言

性激素屬于同化激素，由于它具有較強的蛋白質同化作用，可以加快動物生長，為動物養殖業帶來顯著的經濟效益，在20世紀曾被廣泛用于動物養殖過程中^[1]。然而，部分性激素化學性質穩定，不易分解，容易在動物組織中形成蓄積和殘留，人類如果長期食用含有這些性激素的動物組織，容易導致機體代謝紊亂、發育異常甚至誘發癌變^[2]。因此，歐盟自20世紀90年代已通過立法，限制或者禁止在動物養殖業中使用性激素^[3]。我國農業部也發布了關于動物飼料和飲用水中禁用藥物的176號公告^[4]，明確禁止己烯雌酚、雌二醇等性激素類藥物的使用。但由于利益的驅使，目前仍然存在動物飼料中非法添加明令禁止的性激素類藥物的現象。所以，不斷加強對動物源食品中性激素類藥物的檢測和評價對保障動物源食品的安全仍然具有重要意義。

目前，動物源食品中性激素殘留檢測的樣品前處理方法主要有液液萃取法^[5，6]、超聲輔助萃取法^[7]、微波輔助萃取法^[8]、基質分散固相萃取法（MSPD）^[9]、加速溶劑萃取法^[10]以及超臨界流體萃取法^[11]等。前3種方法幾乎都需要使用乙腈、甲醇、叔丁基甲醚等有機溶劑，存在操作復雜、耗時多、有機溶劑用量大、對操作人員有毒害風險等問題。MSPD多用于蔬菜、水果中藥物殘留的前處理，在動物源尤其是肉類中的應用較少。最后兩種方法中都需要配置專門的設備，投資較大，難以得到普遍推廣和應用。1，1，1，2四氟乙烷（R134a）的破壞臭氧潛能值（ODP）為0，全球變暖系數值（GWP）為0.29，所以常作為一種新型環保的制冷劑使用。同時，R134a的介電常數（ε=9.5）和偶極距（DM=2.05）與二氯甲烷（ε=9.08， DM=1.55）十分接近，因此具有與二氯甲烷類似的溶劑性質，而且化學性質穩定且具有良好的安全性能（不易燃、不易爆、無毒、無腐蝕性）^[12]，所以目前已成為一種新型和綠色環保的萃取介質，受到了越來越多的研究和重視^[13，14]。近幾年，利用亞臨界R134a萃取技術作為一種可替代超臨界CO2前處理技術的新型樣品前處理技術，已成功應用于持久污染物和藥物殘留的檢測^[15-17]。與傳統的溶劑萃取法相比，亞臨界R134a萃取效率高，操作簡便，能同時完成萃取和分離，大大縮短操作時間，而且不造成環境污染。與超臨界CO2萃取法相比，亞臨界R134a在低壓和接近常溫的條件下即可達到符合檢測要求的萃取效果，對設備要求低，操作條件溫和，更容易得到推廣和應用。

本實驗利用亞臨界R134a萃取技術作為樣品的前處理技術， 并通過與氣相色譜質譜的聯用，建立同時檢測魚肉中6種性激素殘留的新方法。本方法操作簡單、溶劑用量少、選擇性好、靈敏度高，為水產品性激素檢測提供了一種高效可靠的檢測方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

亞臨界萃取裝置（自行設計，見圖1），68905973氣相色譜質譜儀（GCMS，美國Agilent公司）， 漩渦混合器（上海康華生化儀器制造廠）。

甲基睪酮、丙酸睪酮（純度>98%，Dr.Ehrenstorfer公司），雌三醇、醋酸甲羥孕酮、β雌二醇乙酸酯、己烯雌酚（純度>98%，Sigma公司）；甲醇、乙腈、丙酮（色譜純）；七氟丁酸酐（Regis）， C18、NH2固相萃取小柱（500 mg，6 mL，上海安譜科學儀器有限公司），SiO2（天津市紅巖化學試劑廠），玻璃纖維（成都市科龍化工試劑廠），R134a制冷劑儲罐（美西英力士公司）。

2.2標準溶液的配制

分別稱取各種激素標準品10 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到100 mg/L的混合標準儲備溶液，于

Symbolm@@ 18 ℃冰箱貯存備用。根據需要將標準貯備液稀釋成不同濃度的標準工作溶液。

2.3亞臨界R134a萃取

稱取絞碎后的魚肉組織樣品4.0 g，置于研缽中，加入12 g SiO2，充分研磨使魚肉均質。然后加入4 g玻璃纖維，與樣品充分混合，使其分散均勻。用鑷子將混勻的樣品裝入萃取釜，加入適量的夾帶劑，然后在萃取釜的底端和頂端均加入少量脫脂棉，以防止樣品堵塞管道。將萃取釜裝入萃取裝置，在設定的條件下進行亞臨界萃取。先靜態萃取20 min，然后動態萃取40 min，流速為1 mL/min。用甲醇作為收集溶液，萃取結束后將收集液置于

Symbolm@@ 18 ℃冰箱中貯存。

2.4樣品純化

將收集液從冰箱中取出，迅速過0.22 μm微孔濾膜，可以去除析出的大量脂肪。將濾液在35 ℃條件下旋轉蒸發濃縮至近干，用1 mL 乙腈溶解殘渣，并加入9 mL水，作為上樣液。

取C18固相萃取小柱，預先分別用5 mL甲醇、5 mL水淋洗柱子，然后將上述上樣液以1 mL/min流速過柱。用5 mL 30%（V/V）甲醇水洗脫雜質，真空抽干。將NH2小柱用5 mL甲醇活化，并串聯在C18小柱下，用2×3 mL甲醇洗脫，洗脫液用N2吹干。

2.5樣品衍生

在吹干后的殘渣中加入100 μL丙酮、50 μL七氟丁酸酐，漩渦混勻30 s，在60 ℃條件下密閉衍生1 h，衍生后用N2 吹干，加入200 μL正己烷溶解，取1 μL進行檢測。

第10期盧 杰等： 亞臨界1，1，1，2四氟乙烷萃取氣相色譜質譜法測定魚肉中

6種性激素殘留

2.6色譜質譜條件

HP5 MS石英毛細管柱（25 m×0.32 mm×0.52 μm）；載氣為高純氦氣，流速1.2 mL/min；不分流進樣，進樣體積1 μL；進樣口溫度250 ℃；柱溫程序：初溫120 ℃，保持2 min，然后以15 ℃/min，升至250 ℃，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。離子源：EI源，電離能量70 eV； 離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；接口溫度：280 ℃；溶劑延遲：3 min；掃描質量范圍：50-800 amu。

3結果與討論

3.1亞臨界R134a萃取條件的優化

3.1.1萃取壓力對回收率的影響壓力是影響亞臨界R134a萃取效率的重要因素。在其它因素固定的情況下，考察了壓力（4， 8和12 MPa）對6種激素的回收率的影響。由圖2可知，隨著壓力的增加，6種激素的回收率均逐漸下降。分析原因可能是隨著壓力的增加，R134a的粘度增加，擴散性能減弱，對基質的滲透能力降低，從而使溶劑分子與目標物的相互作用減弱；另一方面，隨著壓力的增加，R134a的物質的量增加，相同條件下夾帶劑甲醇所占的比例降低，從而使整個二元體系（R134a甲醇）的極性降低，對目標物的溶解能力下降。因此，本實驗選擇萃取壓力為4 MPa。

3.1.2萃取溫度對回收率的影響設定萃取壓力為4 MPa，添加夾帶劑甲醇6 mL，考察萃取溫度對6種激素回收率的影響。由圖3可知，在30 ℃時，6種激素的回收率均達到最大，隨著溫度升高，6種激素的回收率逐漸降低。溫度升高，溶質的擴散系數增加，這有利于目標物在R134a中的溶解；但另一方面，在恒定的壓力條件下，隨著溫度升高，R134a的密度逐漸下降，從而對目標物的溶解能力逐漸降低。并且，隨著萃取溫度升高，R134a的密度下降可能占主導作用，因此6種激素的回收率隨著溫度的升高而降低。本實驗選擇萃取溫度為30 ℃。

3.1.3夾帶劑甲醇用量對回收率的影響夾帶劑可以顯著改善超/亞臨界流體的溶解性能，所以本實驗在萃取壓力和溫度分別確定為4 MPa和30 ℃后，選定甲醇作為本實驗的夾帶劑，考察了甲醇用量對回收率的影響。由圖4可見，當不加夾帶劑時，6種激素的回收率均低于40%，達不到檢測的要求。隨著夾帶劑用量的增加，各種激素的回收率逐漸增大。當夾帶劑用量為6 mL時，6種激素的回收率均能達到87%以上。在完全達到檢測標準和要求的情況下，為了盡量減少有機溶劑的使用，本實驗最終確定夾帶劑甲醇的用量為6 mL。

1. 己烯雌酚（Diethylstilbestrol）； 2. 甲基睪酮（Methyltestosterone）； 3. 雌三醇（Estrio）； 4. β雌二醇乙酸酯（βEstradiol acetate）； 5. 丙酸睪酮（Testosterone propionate）； 6. 醋酸甲羥孕酮（Medroxyprogesterone acetate）。[HT5][TS）]

3.2凈化方法的選擇

由于共萃物中有大量的脂類雜質容易堵塞固相萃取小柱，所以萃取液在上柱前必須經過去脂步驟。有機溶劑去脂法容易造成目標物的損失，而冷凍過濾是一種純物理方法，其原理主要是依據脂肪雜質與目標物在甲醇中溶解度的不同。在低溫下，脂肪會大量析出，而目標物仍然溶解在甲醇中，從而通過過濾將目標物與雜質分開。樣品溶液經過冷凍過濾去脂后，用C18和NH2固相萃取小柱雙柱串聯對其進行凈化。最終，目標化合物與雜質達到良好的分離效果，滿足了檢測分析的要求。

3.3線性關系、標準曲線以及檢出限

用甲醇將標準儲備液逐級稀釋成濃度為5-1000 μg/L系列標準工作溶液，在設定的儀器條件下進行測定。以目標物衍生產物定量離子的峰面積y對相應的質量濃度 x（μg/L）繪制標準曲線，6種性激素的線性相關系數均大于0.99。以3倍的信噪比（S/N）計算各化合物的檢出限（LOD），6種性激素的LODs為0.2-1.0 μg/kg。各目標物經七氟丁酸酐衍生后，通過儀器分析衍生物的質譜圖并結合文獻[18，19]， 確定各化合物的特征離子。6種激素的保留時間、特征離子、標準曲線、相關系數以及檢出限見表1。

Fig.5Chromatograms of 6 sex hormones standards （a） and practical sample （b）

1. 己烯雌酚（Diethylstilbestrol）； 2. 甲基睪酮（Methyltestosterone）； 3. 雌三醇（Estriol）； 4. β雌二醇乙酸酯（βEstradiol acetate）； 5. 丙酸睪酮（Testosterone propionate）； 6. 醋酸甲羥孕酮（Medroxyprogesterone acetate）。[HT5][TS）]

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