谷氨酸甲基化修飾的基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜分析

摘要[HTSS]利用基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜（MALDITOF/TOF）高置信度地鑒定了枯草芽孢桿菌中的蛋白酶抑制劑和桿菌肽F兩種蛋白及其翻譯后修飾，發現在這兩種蛋白質中共有5個肽段發生谷氨酸甲基化，其中肽段FELVVYDSEHK存在FE（Methylation）LVVYDSEHK和FELVVYDSE（Methylation）HK兩種形式。結果表明，MALDITOF/TOF高能CID所提供的豐富斷裂信息和全質量范圍掃描對提高分析結果的確定性具有重要作用。此外，這5個甲基化肽段都可以檢測到相對含量更高的非甲基化肽段，這為降低分析結果的假陽性提供了輔助判據。在低質量區檢測到甲基化賴氨酸的亞胺相關離子m/z 98和143，說明發生了賴氨酸的甲基化；檢測到m/z 116則提示發生了谷氨酸甲基化。

1引言

蛋白質的翻譯后修飾（Posttranslational modifications， PTMs）是一個高度動態和多樣化的過程，與嚴格的基因表達調控方式相比，PTMs更容易創造蛋白質性質的動態組合庫，使得生物體能夠快速適應各種環境刺激^[1]，因此，PTMs是蛋白質的功能調控、相互作用和動態反應的重要分子基礎^[2]。PTMs主要包括蛋白質的磷酸化、糖基化、泛素、乙酰化和甲基化等，其中蛋白質磷酸化和糖基化蛋白質組學的研究開展較早，針對這兩種化學修飾蛋白建立了多種特異性分離方法^[3-7]。

目前，對蛋白質的甲基化修飾研究相對較少。早期研究發現，組蛋白賴氨酸與精氨酸殘基的甲基化基因轉錄調控相關^[8]。2008年，Sprung等^[9]在人肝癌細胞和啤酒酵母中檢測到了天冬氨酸和谷氨酸的甲基化修飾；有研究表明，與正常胰管細胞相比，在胰腺癌細胞的α烯醇酶中有更多的天冬氨酸和谷氨酸發生甲基化，提示這些修飾可能參與了與腫瘤相關的病理生理過程^[10]，以上工作均是在靜電場軌道離子阱質譜（LTQOrbitrap）上完成。目前，尚未見到利用基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜（Matrixassisted laser desorption ionization tandem timeof flight mass spectrometry， MALDITOF/TOF）分析谷氨酸甲基化的報道。本研究以枯草芽孢桿菌為實驗材料，通過對一級質譜離子峰豐度的比較和二級串聯質譜的分析，闡明利用MALDITOF/TOF質譜分析谷氨酸甲基化的特點和優勢，提高含甲基化谷氨酸多肽和蛋白的鑒定置信度，為在組學水平上研究谷氨酸甲基化的生物學功能奠定基礎。2實驗部分

2.1儀器與試劑

4800 MALDI TOF/TOFTM Analyzer基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜儀（MALDITOF/TOF，美國Applied Biosystems/MDX SCIEX公司），儀器控制軟件為4700 Series Explorer Software；超純水處理系統（ MilliQ，美國Millipore 公司）；蛋白純化系統（AKTA FPLC，美國GE公司）；320S型pH計（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；胰蛋白酶（質譜分析級，Promega公司）；α腈基4羥基肉桂酸（美國Sigma公司，使用前重結晶）；乙腈和三氟乙酸等其它試劑均為分析純或優級純。

枯草芽孢桿菌從深圳紅樹林海泥中分離。

2.2膠內胰酶水解條件

切膠：將雙向電泳分離后的目標條帶用移液槍槍頭切下，小心地放入PCR管；脫色：用100 μL 高純水振蕩洗滌10 min，重復3次；100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min；100 μL 25 mmol/L NH4HCO3/50%乙腈室溫振蕩30 min；干燥膠粒：100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min；加100 μL 100%乙腈于膠粒中靜置10 min，重復1次；酶解：加入5 μL 20 mg/L質譜用測序級胰蛋白酶，4 ℃放置30 min，使酶液完全浸透膠粒，吸掉多余的酶液；加入5 μL 40 mmol/L NH4HCO3/10% CAN混合液， 37 ℃水浴8 h。

2.3質譜分析條件

基質制備：將6 g/L α腈基4羥基肉桂酸和2 g/L 檸檬酸氫二胺溶于10 mL 50%乙腈（含0.1%三氟乙酸），基質溶液與蛋白酶解液1∶1混合后點于不銹鋼靶版，自然干燥結晶后待測。采用正離子反射模式，一級質譜每張譜圖累加800次，二級質譜累加1200次，碰撞誘導解離條件為： 碰撞能加空氣碰撞1 kV（gas on），源內電壓8 kV，碰撞池電壓7 kV，二級源加速電壓15 kV。

2.4數據分析方法

數據庫搜索條件：串聯質譜數據信噪比設為5，一級和二級質譜質量誤差均設為±0.3 Da，Mascot 軟件分析， 搜索數據庫NCBI 2012年8月發布，甲硫氨酸氧化和谷氨酸甲基化作為可變修飾。當Mascot 分數接近或小于可信閾值時，利用Data Explorer提供的離子碎片計算器（Ion fragmentation calculator）和ProteinProspector MSProduct program輔助進行人工解析。

3結果與討論

3.1枯草桿菌細胞內蛋白酶抑制劑BsuPI中谷氨酸的甲基化

因為谷氨酸的甲基化屬于不常見的翻譯后修飾，所以最初搜庫時未被列入可變修飾中。將搜庫文件提交到Mascot引擎檢索后，一個目的蛋白被鑒定為枯草桿菌細胞內蛋白酶抑制劑BsuPI，同時發現存在3組分子量相差14 Da的[M+H]+峰，如圖1所示，它們的質荷比分別為1303.80，1317.81； 1365.77，1379.82； 2313.34，2327.36，加14 Da的[M+H]+峰的豐度很低且未被數據庫匹配，這提示可能存在蛋白的甲基化修飾現象。

由于甲基化不引起電荷變化，可以認為同一組內肽段電離效率相近，離子豐度的高低可以反映其含量的相對大小，所以這也提示對某種特定蛋白質而言，只有極少部分發生了甲基化修飾。由于甲基化可能發生在賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和谷氨酸7種氨基酸殘基上^[9]，并且蛋白質結構的多樣性也有可能造成質荷比的巧合，所以需進一步確認。由于數據量較小并且串聯質譜的譜圖質量較高，先進行人工解析。圖2a和圖2b分別為m/z 1365和1379的串聯質譜圖，m/z 1365的鑒定結果為肽段FELVVYDSEHK。除離子強度外，二者譜圖輪廓非常相似，說明它們結構相近，的確發生了該肽段上氨基酸的甲基化修飾。檢測到了肽段FELVVYDSEHK的全部互補的b和y系列離子，例如b2，b3離子分別為m/z 277.12，390.19（理論值277.12，390.20），而在圖3上清楚可見m/z 291和404，對應肽段氨基端第二位的谷氨酸（E）上發生甲基化，檢測到完整的y1 至y9離子、b10 （m/z 1233）和b10+H2O （m/z 1251）離子也證明該判斷正確。肽段的[M+H]+離子在碰撞誘導解離過程中會產生b+H2O離子的現象最早報道于1990年，隨后，She等基于串聯四級桿飛行時間質譜對該現象進行了進一步研究，提出對于由n個氨基酸殘基組成的肽段，如果序列中存在非C端堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸），則在質子化側鏈和第n1個羰基氧之間可能形成氫鍵，丟失C末端氨基酸和形成新的C末端^[11]，從而形成bn1+H2O離子。因為肽段FELVVYDSEHK含有組氨酸且由11個氨基酸組成，所以圖2和圖3中檢測到的b10+H2O峰可以用上述機制解釋。值得注意的是，在圖3的低質量區同樣檢測到了m/z 277和390離子，進一步分析發現，還存在羧基端第三位谷氨酸甲基化的y3y7離子（用*表示）。因此，串聯質譜結果表明肽段FELVVYDSEHK的兩個谷氨酸殘基上分別發生了甲基化。

3.2枯草芽孢桿菌兩種甲基化蛋白的數據庫檢索結果

本實驗的樣品來源是芽孢桿菌蛋白提取液經離子交換和分子篩層析分離篩選出的具有生物活性的蛋白，經雙向電泳上共獲得6個蛋白點，將谷氨酸甲基化修飾添加為可變修后搜庫檢索，共檢測到兩種蛋白發生甲基化修飾（表1）。在枯草桿菌細胞內蛋白酶抑制劑BsuPI中，肽段QVQAVQQFEVK和MENQEVVLSIDAIQEPEQIK 也存在甲基化現象，匹配分數很高，人工比對結果與搜庫結果一致。但數據庫檢索只給出了肽段FELVVYDSEHKER的N端第2位谷氨酸發生甲基化的結果，這可能是因為該肽段的離子序列更完整和豐度更高，目前Mascot搜索引擎對于同一肽段的混合修飾較還難給出精確結果。此外，在桿菌肽F（Bacillopeptidase F）也觀察到了谷氨酸甲基化修飾現象，與細胞內蛋白酶抑制劑的分析類似，甲基化肽段ATDGVEWNVDQIDAPK和AFSEDGGTDADILEAGEWVLAPK的[M+H]+峰在一級譜中信號很弱（相對強度<4%），但依然能夠給出谷氨酸甲基化的確切信息，甚至可以用于從頭測序分析。目前，關于谷氨酸甲基化與蛋白質活性、功能和信號通路之間的關系的研究還較少，也未見在枯草芽孢桿菌中發現這兩個蛋白的甲基化修飾報道，本研究所發現的這兩種蛋白都屬于酶類，提示谷氨酸的甲基化修飾具有重要的生物學意義。

目標肽段被鑒定為EVAQDFKTELR，在谷氨酸甲基化和賴氨酸甲基化同時作為可變修飾的條件下目標肽段被鑒定為EIAQDFKTDLR，二者的Mascot打分分別為33和53分，都低于p<0.05的閾值，雖然從得分上分析應該是后者更為可信，但利用亞胺離子的信息可給出更準確的結果。賴氨酸的亞胺離子為m/z 101，但該離子豐度一般很低；相反，賴氨酸亞胺相關離子m/z 84和129強度較高，在圖3的低質量區明顯觀察到了m/z 98和143離子，這分別對應它們加上14 Da，因此，可以肯定是賴氨酸甲基化。如果是谷氨酸甲基化，則如圖4A和圖4B的對比所示，將在m/z 116處觀察到明顯區別于噪音的信號峰，對應谷氨酸亞胺離子（m/z 102）加上14 Da。相比于組氨酸、脯氨酸和色氨酸等，谷氨酸的亞胺離子強度較弱，并與肽鏈長短、谷氨酸在肽鏈中的位置、碰撞條件和累積時間等因素，在本工作中，只有在長肽段AFSEDGGTDADILEAGEWVLAPK的TOF/TOF譜圖中未檢測到m/z 116離子。值得注意的是，這種MALDITOF/TOF類型儀器有兩種操作模式：1 kV，Gas on和2 kV， Gas off，二者的區別在于前者通過空氣碰撞可以提供豐富的亞胺離子信息，

綜上所述，如果檢測到分子量相差14Da的離子對并且大分子量離子的強度明顯偏低，則提示可能發生了甲基化修飾，如果觀察到m/z 166處的谷氨酸亞胺離子，則可為發生谷氨酸甲基化提供第一步判據，修飾位點的最終確定需依賴高質量的串聯質譜。另一方面，本文在枯草芽孢桿菌的為細胞內蛋白酶抑制劑BsuPI和桿菌肽F中檢測到了5個谷氨酸甲基化肽段，發現了肽段FELVVYDSEHK中兩個谷氨酸分別存在甲基化，這不僅為下一步生物學研究提供了新線索，也說明MALDITOF/TOF質譜高能CID是研究蛋白質甲基化修飾的合適方法。本研究表明，由于肽段不同位置谷氨酸的甲基化修飾而產生同分異構體的混合譜是可能的，目前數據庫檢索方法對這類混合譜尚較難處理，因此與肽段從頭測序分析的要求類似^[16]，對搜庫結果進行手工驗證是必要的。

References

1Davis B G. Science， 2004， 303： 480-482

2TAN YongCong， WANG QiJun， ZHAO GuoPing， YAO YuFeng. Progress in Biochemistry and Biophysics， 2011， 38（3）： 197-203

譚永聰， 王啟軍， 趙國屏， 姚玉峰. 生物化學與生物物理進展， 2011， 38（3）： 197-203

3Zhou H J， Ye M L， Dong J， Han G H， Jing X N， Wu R N， Zou H F. J. Proteome. Res. ， 2008， 7（9）： 3957-3967

4Jia W， Luo Z， Fu Y， Wang H P， Wang L H， Chi H， Yuan Z F. Mol. Cell. Proteomics.， 2009， 8（5）： 913-923

5JIANG Jing， HAN HuanHuan， MA Cheng， WANG JiFeng， YING WanTao， QIAN XiaoHong. Chinese J. Anal.Chem.， 2012， 40（7）： 1019-1024

江 靜， 韓歡歡， 馬 成， 王繼峰， 應萬濤， 錢小紅. 分析化學， 2012， 40（7）： 1019-1024

6Cheng G， Zhang J L， Liu Y L， Sun D H， Ni J Z. Chem. Commun.， 2011， 47： 5732-5734

7Xu Y W， Wu Z X， Zhang L J， Lu H J， Yang P Y， Webley P A， Zhao D Y. Anal. Chem.， 2009， 81： 505-508

8Strahl B D， Allis C D. Nature， 2000， 403： 41-45

9Sprung R， Chen Y， Zhang K， Cheng D M， Zhang T， Peng J M， Zhao Y M. J. Proteome. Res.， 2008， 7（3）： 1001-1006

10Zhou W D， Capello M， Fredolini C， Piemonti L， Liotta L A， Novelli F， Petricoin E F. J. Proteome. Res.， 2010， 9（6）： 2929-2936

11She Y， Krokhin O， Spicer V， Loboda A， Garland G， Ens W， Standing K G. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2007， 18（6）： 1024-1037

12Medzihradszky K F， Campbell J M， Baldwin M A， Falick A M， Juhasz P， Vestal M L， Burlingame A L. Anal. Chem.， 2000， 72： 552-558

13Vestal M L， Campbell J M. Methods in Enzymology， 2005， 402： 79-107

14Khatun J， Ramkissoon K， Giddings M C. Anal. Chem.， 2007， 79（8）： 3032-3040

15Huang L， Baldwin M A， Maltby D A， Medzihradszky K F， Campbell J， Juhasz P， Martin S A， Vestal M L， Burlingame A L. Mol. Cell. Proteomics， 2002， 1： 434-450

16Seidler J， Zinn N， Boehm M E， Lehmann W D. Proteomics， 2010， 10： 634-649