以苯硼酸為識別物質的電化學阻抗糖傳感器的制備

1引言

糖類在生物體中起著極其重要的作用。它涉及生物學及病理學過程，如信號傳導、細胞粘附、癌癥轉移等過程，也是生物體進行新陳代謝所需能量的主要來源^[1-3]。因此，分析檢測糖類化合物顯得十分重要。目前，已報道的糖類化合物分析方法有電化學法^[4]、電化學發光法^[5]、熒光法^[6]、石英晶體微天平法^[7]、表面等離子體共振法^[8]等。電化學交流阻抗技術（EIS）是利用小幅度交流電壓或電流對電極擾動，測量體系對擾動跟隨情況的電化學響應的測量方法。該方法具有頻率范圍廣、對體系擾動小等特點，是研究電極過程動力學、電極表面現象等的重要工具^[9，10]。

目前，糖類化合物的檢測主要基于糖和與糖可結合分子（如糖結合蛋白、凝集素、硼酸基團等）之間的弱相互作用^[11-13]。硼酸及其衍生物能與二醇可逆高效地共價結合而形成環狀的硼酸酯，因此可將其作為生物傳感器的分子探針來識別糖類化合物^[14-16]。相比糖傳感器的其它識別單元，硼酸具有價格低廉、穩定性好、易可逆再生等優點^[17]。已報道的作為分子識別物質檢測糖的硼酸有苯硼酸、氨基苯硼酸、巰基苯硼酸等^[18，19]，其中巰基苯硼酸因易在空氣中氧化、室溫下不穩定等缺點在生物傳感應用方面受到限制。合成穩定的硼酸類衍生物作為糖傳感器的識別單元是糖傳感器研究的一個方向^[20]。

本研究選擇苯硼酸為糖的識別物質，首先由半胱胺與4甲酰基苯硼酸反應合成Schiff′s堿，通過自組裝方式將合成的硼酸Schiff′s堿固定于金電極表面，以電化學交流阻抗法為檢測技術，構建非標記、靈敏度高、穩定性好的電化學交流阻抗糖傳感器。電極上固定的硼酸可與糖化合物上的二醇可逆、高效地共價結合形成環狀的硼酸酯，利用傳感器與糖結合前后阻抗值的變化，分析檢測葡萄糖、乳糖和甘露聚糖，并且分別考察傳感器與3種糖的結合能力。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

電化學系統為CHI 660電化學分析儀（上海辰華儀器公司），電極為三電極體系：工作電極為金電極（Φ=2 mm）或修飾電極，對電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl（飽和KCl）電極。

半胱胺（Cysteamine，CA，Mw=77.15 g/mol）、甘露聚糖（Mannan from Saccharomyces cerevisiae，Mw =46000 Da）和4甲酰基苯硼酸（4Formylphenylboronic acid，BA，Mr=149.94 g/mol），均購自SigmaAldrich公司。乳糖（C12H22O11·H2O，天津市化學試劑一廠）。葡萄糖（C6H12O6·H2O，西安化學試劑廠）。其余所有試劑均為分析純。實驗所用水為MilliQ超純水（

18.2 MΩ cm，Millipore公司）。

0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）。0.2 mol/L半胱胺溶液的配制：準確稱取0.1543 g半胱胺，以超純水溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，避光保存備用。0.2 mol/L 4甲酰基苯硼酸溶液的配制：準確稱取0.3000 g 4甲酰基苯硼酸，用5 mL無水乙醇溶解后，加入5 mL碳酸鹽緩沖液（pH 9.0）定容至10 mL容量瓶備用。葡萄糖、乳糖、甘露聚糖儲備液均由0.1 mol/L PBS（pH 7.4）配制，其中葡萄糖的儲備液需放置24 h后使用。不同pH值的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]K4[Fe（CN）6]檢測溶液分別用不同pH值的0.1 mol/L PBS配制。

2.2電化學糖傳感器的構建

傳感器的構建步驟如圖1所示。（1）Schiff′s堿（BACA）的制備移取5 mL 0.2 mol/L半胱胺水溶液于圓底燒瓶中，向其中逐滴加入5 mL 0.2 mol/L 4甲酰基苯硼酸溶液，40 ℃水浴反應2 h，得到淡黃色沉淀，過濾，洗滌，干燥，得到Schiff′s堿（BACA）^[21]。Schiff′s堿的核磁共振氫譜數據如下：1H NMR（300 MHz，CD3OD），δ=3.90（s，4H，CH2CH2）， δ=8.32（s，1H，N=CH）， δ=7.43-7.48（s，4H，ArH）。準確稱取0.0400 g Schiff′s堿（BACA），溶于1 mL無水乙醇中，制得0.04 g/mLSchiff′s堿儲備溶液。（2）糖傳感器的制備金電極的預處理：將金電極用0.03 μm Al2O3溶膠研磨，然后依次用乙醇、超純水分別超聲清洗5 min，再將金電極在0.1 mol/L H2SO4溶液中，0 - 1.5 V電位范圍內進行循環伏安掃描，直至獲得穩定的循環伏安曲線，用超純水淋洗后備用。將預處理好的金電極浸入0.04 g/mL Schiff′s堿的溶液中，室溫下組裝4 h，用大量0.01 mol/L PBS沖洗，制備獲得苯硼酸修飾糖傳感器（BACA/Au），將傳感器置于4 ℃冰箱中保存待用。

[TS（][HT5”SS]圖1苯硼酸電化學交流阻抗傳感器的制備和檢測糖原理圖

Fig.1Schematic representation of phenylboronic acidbased electrochemical sensor for determination of saccharide[HT5][TS）]

分 析 化 學第41卷

第10期李叢叢等： 以苯硼酸為識別物質的電化學阻抗糖傳感器的制備

2.3電化學測定

3結果和討論

3.1傳感器的電化學交流阻抗法表征

3.2實驗條件的優化

3.2.1組裝時間和結合時間的選擇巰基組裝時間對傳感器電化學交流阻抗值的影響見圖3A。在0.5-4.0 h之間改變組裝時間，傳感器結合435 nmol/L甘露聚糖1 h前后電子傳遞阻抗變化當平衡電對溶液pH=9.5時，苯硼酸修飾電極的阻抗值達到最大。這主要是苯硼酸基團以中性或帶負電荷的陰離子形式存在，其pKa≈9.0 [14]。苯硼酸與4.35 nmol/L甘露聚糖結合后在不同pH值的平衡電對中的阻抗變化如圖4b所示，當平衡電對pH=9.0時，阻抗值最大，相比苯硼酸修飾電極的最佳pH值有所降低，與文獻[14，22]一致。為了使傳感器結合糖前后硼酸與硼酸酯基團所帶電荷引起的阻抗差別最大，選擇pH=9.0的K3[Fe（CN）6]K4[Fe（CN）6]平衡電對溶液作為檢測溶液。

3.3電化學糖傳感器的分析特性

3.3.1傳感器與糖結合常數的計算根據Szymanska的報道^[25]，利用EIS技術，依據公式（1）和（2）計算傳感器與糖的結合常數。在一定濃度范圍內，lg（ΔRet

3.3.2線性范圍和檢出限在優化的實驗條件下，利用糖傳感器分別對葡萄糖、乳糖及甘露聚糖進行測定。圖6為糖傳感器分別結合不同濃度的3種糖的Nyquist阻抗圖譜和線性關系。電子傳遞電

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