電致化學發光分子印跡傳感器測定L苯丙氨酸

1引言

L苯丙氨酸（Phe）是人體8種必需氨基酸之一，在多種疾病的診斷治療和病理學研究上具有重要意義^[1-3]。目前測定Phe的方法有高效液相色譜法^[4]、氣相色譜質譜法^[5]、電化學法^[6]等，但這些方法存在靈敏度不高、選擇性不好、儀器昂貴等問題。

電致化學發光法（ECL）因其靈敏度高、儀器簡單、檢測快速等優點，已被應用于氨基酸的檢測^[7，8]。三聯吡啶釕（Ru（bpy）2+3）是目前應用最廣泛的發光試劑。由于Ru（bpy）2+3參與化學反應前后的形態和性質基本保持不變，將其固定到電極上反復使用，不僅節約了試劑，有效降低了檢測成本，還簡化了實驗裝置^[9-11]。

分子印跡聚合物（MIP）對目標分子具有良好的特異性識別的能力，已被廣泛應用于化學、生物等諸多研究領域。溶膠凝膠法制得的印跡傳感器具有物化性質穩定，檢測快速且操作簡便等優點^[12]。已有文獻報道用該印跡傳感器測定血漿樣品中的L苯丙氨酸，檢出限為1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L^[13]。

將電致化學發光和分子印跡技術相結合，既可解決電致化學發光法的選擇性問題，又可有效提高分子印跡傳感器的檢測靈敏度^[14-16]。本研究在Ru（bpy）2+3固相電極上電沉積溶膠凝膠分子印跡膜，制備了一種對Phe的測定兼有高靈敏度和良好選擇性優點的傳感器。此傳感器可應用于尿樣中Phe的快速檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1ECL電極制備條件的優化

3.1.1ECL電極的電化學和ECL性能碳納米管由于其優良的電學性能已被應用于Ru（bpy）2+3的固定化研究^[17]。圖1A是Nafion電極（a）和 ECL電極（b）在含有1.0 ×10

Symbolm@@ 5 mol/L Phe的PBS溶液中的循環伏安曲線。曲線b的峰電流明顯大于曲線a，說明MWCNTs的引入提高了電極表面的電子傳輸速率。圖1B給出了兩種電極的發光強度。ECL電極的發光強度是Nafion電極的9倍，表明MWCNTs能顯著提高方法的靈敏度。

本研究采用烷氧基硅烷作為印跡材料。圖3為電沉積溶膠凝膠印跡膜的循環伏安圖。隨著掃描圈數的增加，電極的響應電流降低直至穩定，說明ECL電極表面已完全被印跡膜所覆蓋。掃描圈數影響分子印跡膜的厚度。掃描圈數越多，膜越厚，而膜太厚不利于模板分子的洗脫，所以本實驗選擇掃描圈數為25。

采用掃描電子顯微鏡觀察了不同修飾電極的表面形貌。圖4A為ECL電極的SEM圖，MWCNTs外徑約為20-40 nm，分布均勻，并鑲嵌于Nafion膜里及其表面。圖4B為ECLMIP電極的SEM圖，MWCNTs外徑約為35-65 nm，粗略算得印跡膜的厚度為15-25 nm。

3.3模板分子的洗脫

模板分子通過非共價鍵與功能單體、交聯劑結合形成印跡聚合物。這種結合方法的洗脫較溫和。試驗了熱水，無水乙醇，0.01 mol/L NaOH溶液和44% 甲酸洗脫模板分子Phe。結果表明，熱水洗脫Phe的過程很緩慢；無水乙醇會溶解分子印跡膜；0.01 mol/L NaOH溶液也會破壞分子印跡膜的完整性，而44%甲酸能快速洗脫模板分子。但由于甲酸濃度太高，易使膜整體脫落。所以本實驗選用44% 甲酸和水交替浸泡電極。隨著洗脫時間的增加，ECL值逐漸減小，4 h后發光值已接近基線，說明模板分子已洗脫完全。

3.4ECLMIP傳感器的電化學性能

圖5為不同電極在K3[Fe（CN）6]溶液中的循環伏安曲線。模板分子洗脫前，電極在溶液中幾乎不導電（曲線a），說明電極表面被致密的印跡膜所覆蓋。隨著洗脫過程的進行，K3[Fe（CN）6] 的峰電流逐漸增大，直至不再變化，此時模板分子已洗脫完全（曲線b）。對比曲線b和c可知，ECLMIP電極的導電能力不及ECL電極。K3[Fe（CN）6]可自由通過分子印跡膜中的孔穴，但大部分電極仍被不導電的分子印跡膜所覆蓋，致使K3[Fe（CN）6] 對ECLMIP電極的電化學響應降低。

[TS（][HT5”SS]圖5不同電極在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]中的循環伏安圖 （a） ECLPhe MIP電極，（b） ECLMIP電極，（c） ECL電極， 掃速：100 mV/s

Fig.5CVs of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe（CN）6] （a） ECLLphenylalanine （Phe）MIP electrode； （b） ECLMIP electrode； （c） ECL electrode scan rate： 100 mV/s.[HT5][TS）]

3.5ECLMIP傳感器的電致化學發光性能

為了驗證傳感器是否能對Phe有效響應，測定了Phe的電致化學發光性能。在電位1.02 V時開始出現發光現象，隨后發光迅速增大，達到最大值時電位為1.14 V，該電位與圖1A曲線b的Ru（bpy）2+3氧化峰電位一致。基于Phe對Ru（bpy）2+3的電致化學發光強度的增強作用，可建立檢測Phe的電致化學發光分析法。

3.6測定條件的優化

考察了緩沖溶液的pH值對ECL強度的影響。溶液呈酸性時，ECL值隨pH值的遞增而不斷增大，pH 7.0 時達到最大值。溶液呈堿性時，發光值未明顯遞減，但空白發光增大，干擾Phe的檢測。本實驗選擇pH 7.0作為最優pH值。

印跡膜中存在著許多孔穴，孔穴的內壁上分布著對模板分子具有特異識別性能的結合位點。實驗發現，在10-120 s范圍內，ECL值隨富集時間的增長而增大；當富集時間大于120 s后，ECL值基本保持不變。表明電極對Phe的吸附已達到平衡，所以選擇富集時間為120 s。

3.7線性范圍和檢出限

3.9傳感器的重現性和穩定性

考察了傳感器對同一濃度Phe的重現性。將傳感器置于待測溶液中富集、掃描后，取出繼續洗脫10 min，可使電極恢復原來的響應狀態。用同一個傳感器平行測定1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液5次，相對標準偏差（RSD）為4.3%；用同樣方法制備的3支傳感器檢測1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液，RSD為4.7%，表明該傳感器具有良好的重現性。為了考察其長期穩定性，將新制備的傳感器洗脫完全后（4 ℃下保存），每星期測定一次1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液。結果表明，前兩周測定的ECL值基本穩定（RSD<5%），但3星期后發光強度出現較為明顯減弱。其原因可能與發光物質的溶出有關，傳感器的長期穩定性有待進一步改進。

3.10樣品測定

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