轉(zhuǎn)基因作物pat蛋白的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法研究

1引言

pat基因（Hosphinothricin acethl transferase）由菌株S. viridochromogenes中分離得到，其Bg/11SsⅡ片段編碼pat蛋白，通過使乙酰輔酶A與草丁膦游離的氨基結(jié)合，形成ACpat復(fù)合物，從而使草丁膦失去活性^[1]。pat基因編碼表達(dá)產(chǎn)物pat蛋白分子量約為23 kDa， 為同源二聚體，由183個氨基酸組成^[2]，屬于乙酰轉(zhuǎn)移酶家族，與乙酰轉(zhuǎn)移酶類具有相對相同的結(jié)構(gòu)和功能^[3]。pat蛋白無直接毒性，與已知的毒蛋白無同源性，也不具過敏原的特性，如熱或消化穩(wěn)定性、無糖基化位點(diǎn)等，且在植物中的表達(dá)量極低^[3]，因此該基因片段也被作為一般轉(zhuǎn)基因作物的標(biāo)記基因。

轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的檢測方法主要有基于核酸水平的檢測方法和基于蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測方法^[4]。核酸檢測方法通過檢測插入的外源基因，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為主^[5，6]，包括巢式PCR^[7]、多重PCR^[8]、競爭性定量PCR^[9]、實(shí)時定量PCR^[10]、和基因芯片^[11]等多種檢測技術(shù)手段。蛋白質(zhì)水平檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）^[12，13]和免疫檢測試紙條法（Lateralflow）^[4]等。免疫檢測試紙條操作簡便、快速，但ELISA檢測方法操作簡單、靈敏度高，適合高通量檢測，可用于轉(zhuǎn)基因外源蛋白的定量檢測。許文濤等^[13]利用所純化的pat蛋白制備得到了抗pat兔多克隆抗體，建立了pat蛋白的檢測方法并對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)行了鑒別，該方法的檢出限為20 μg/L。本研究利用所制備的抗pat蛋白鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體，建立了pat蛋白的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法，方法靈敏度高，可用于轉(zhuǎn)基因作物中pat蛋白的定性和定量檢測。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀（美國BioRad公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一儀器公司）；搖床及電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；Wellwash 4 MK自動洗板機(jī)（芬蘭Thermo公司）；Centrifuge 5810 R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Costar公司）。

克隆載體pGEMT MD18（Promega公司）、pEASYBlunt（TransGen Biotech公司）； 克隆質(zhì)粒WLBC9轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存）；大腸桿菌（E.Coli）菌株DH5α（T公司），原核表達(dá)菌株BL21（TIANGEN公司）；Taq DNA聚合酶（TIANGEN公司）； 硅膠模型TMPCR產(chǎn)物純化試劑盒（賽百盛公司和TIANGEN公司）；T4連接酶、LATaq酶、EcoR1酶、Not1酶、HindⅢ（美國NEB公司）；Ampicillin（Amp）、Kanamycin（Kan）（美國Sigma公司）；PCR擴(kuò)增引物（北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；蛋白純化試劑盒、原核表達(dá)Overnight Express TB培養(yǎng)基（德國Merck公司）。

辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（IgGHRP）、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）和TMB顯色液均購自美同Sigma 公司；HRPDAB底物顯色試劑盒購于TIANGEN公司，甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）；鼠抗體亞型ELISA鑒定試劑盒（美國Pierce公司），其它化學(xué)試劑均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）。

包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液等免疫檢測緩沖液配方參考文獻(xiàn)[14]。

2.2實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和非轉(zhuǎn)基因棉花材料由河間市國欣農(nóng)村技術(shù)服務(wù)總會提供。

6-7周齡Bal b/c雌性小鼠、新西蘭長耳兔（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心）；SP 2/0骨髓瘤細(xì)胞（中國獸藥監(jiān)察所）。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1pat基因的克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)已知序列信息和NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）公布序列信息顯示，pat基因包括原始序列（Sequence）及經(jīng)過人工改造后的合成序列（Sequence）。對這兩種基因及pat基因進(jìn)行序列分析，并在實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒WLBC9未知轉(zhuǎn)基因構(gòu)建質(zhì)粒全序列的情況下，根據(jù)兩種序列公布信息，分別利用Primer 5軟件設(shè)計相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物序列，篩選并克隆目標(biāo)基因片段。回收并連接測序載體pMD18 Simple Tvector，測序鑒定，于NCBI進(jìn)行Blast比對后，將測序正確的質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET30a（+）同時用限制性內(nèi)切酶EcoR1和HindⅢ雙酶切。用連接酶連接雙酶切后的目標(biāo)基因片段與原核表達(dá)載體pET30a（+）片段，構(gòu)建pat蛋白的原核表達(dá)載體，質(zhì)粒經(jīng)二次酶切測序比對驗(yàn)證，完成pat蛋白重組質(zhì)粒RP14的構(gòu)建。

2.3.2pat蛋白在大腸桿菌中的原核表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒RP14經(jīng)質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，取菌斑于普通LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)兩個階段后，轉(zhuǎn)化BL21菌株，轉(zhuǎn)入Overnight expressTB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，10000 g離心后經(jīng)吹打沉淀，分離上清液及沉淀（包涵體），分別取適當(dāng)量經(jīng)過SDSPAGE電泳，確定蛋白片段大小正確后，取上清液經(jīng)Merck公司His Bind蛋白親和純化試劑盒進(jìn)行過柱洗脫純化并收集，冷凍干燥，

Symbolm@@ 40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3動物免疫Bal b/c雌性小鼠免疫： 0.01 mol/L PBS將pat蛋白稀釋成1.0 g/L，初次免疫用完全弗氏佐劑與等體積的免疫原混合，充分乳化，免疫5只小鼠，每只小鼠免疫劑量為200 μL。加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑乳化。免疫部位為腹腔或背部皮下。經(jīng)過5次免疫后，對小鼠血清進(jìn)行檢測。

新西蘭長耳兔免疫： 0.01 mol/L PBS將pat蛋白稀釋成2.0 g/L，初次免疫用完全弗氏佐劑與等體積的免疫原混合，充分乳化，免疫2只新西蘭長耳兔，每只兔子免疫劑量為1.0 mL，免疫部位為后足掌墊處。加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑乳化。每只兔子注射1.0 mL，免疫方式為背部皮下多點(diǎn)注射。經(jīng)過3次免疫后，對兔血清進(jìn)行檢測，達(dá)要求后立即放血收集多克隆抗體。

2.3.4血清效價測定小鼠經(jīng)過第5次免疫后第6天，用毛細(xì)玻璃管從眼眶取少量血液，室溫靜置1 h，4 ℃過夜，4000 r/min離心10 min，收集血清，4 ℃保存。血清效價的測定采用間接ELISA方法^[14]。效價定義為OD值為1.0時的抗血清最大稀釋倍數(shù)。新西蘭長耳兔血清效價測定同小鼠血清效價測定。

2.3.5單克隆抗體的制備、抗體純化和鑒定

單克隆抗體的制備和純化同參考文獻(xiàn)[15]。

抗體效價：間接ELISA方法測定抗體的效價^[14]。單克隆抗體類型鑒定：鼠抗體亞型ELISA鑒定試劑盒檢測。抗體特異性：Western Blot和交叉反應(yīng)率表示抗體的特異性。

2.3.6兔多克隆抗體的制備與純化將收集血液轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，室溫下以不高于水平面30°斜角靜置，收集析出血清。離心取上清液，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，蒸餾水內(nèi)透析后凍干，于

Symbolm@@ 40 ℃冰箱保存。

2.3.7雙抗夾心ELISA的建立兔多抗用包被緩沖液稀釋至工作濃度，37 ℃溫育3 h，棄包被液，洗液洗板4次；將100 μL不同濃度（0， 1.56， 3.13， 6.25， 12.5， 25， 50和100 μg/L）的pat蛋白液加入酶標(biāo)板，每個濃度重復(fù)3次， 37 ℃溫育0.5 h，洗板4次； 加入100 μL稀釋至工作濃度的單抗溶液，37 ℃ 溫育0.5 h，洗板4次。洗板后加入1000倍稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠抗體，置于37℃溫育0.5 h，洗板4次； 每孔加入100 μL底物緩沖液，避光顯色10 min后，每孔加50 μL終止液于450 nm波長下測各孔OD值。以純化蛋白濃度的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.8pat蛋白檢測稱棉花葉片樣品1.0 g，加5 mL PBS研磨后4 ℃靜止提取4 h， 3000 r/min離心取上清液。將上清液冷凍干燥后，以1 mL 蒸餾水溶解，取100 μL上清液，用于pat蛋白含量測定。檢測方法同2.3.7節(jié)。

3結(jié)果與討論

3.1pat蛋白的表達(dá)、純化及免疫原的制備

3.1.1pat蛋白的表達(dá)根據(jù)已知序列信息和網(wǎng)站公布序列信息顯示，pat基因有原始序列（Native sequence）及經(jīng)過人工改造后的合成序列（Ynthetic sequence）。對這兩種基因及bar基因進(jìn)行序列分析，并在實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒WLBC9未知轉(zhuǎn)基因構(gòu)建質(zhì)粒全序列的情況下，根據(jù)兩種序列公布信息，分別利用Primer 5軟件設(shè)計相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物序列。經(jīng)過引物配對擴(kuò)增驗(yàn)證，質(zhì)粒中所含有pat序列為人工合成序列，序列如下：

擴(kuò)出條帶為pat基因的目的條帶，約550 bp。回收并連接測序載體pMD18 Simple Tvector，測序鑒定比對，得到正確表達(dá)的質(zhì)粒。將測序正確質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET30a（+）同時用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Not1雙酶切，構(gòu)建pat蛋白的原核表達(dá)載體，質(zhì)粒經(jīng)二次酶切測序比對驗(yàn)證，完成pat蛋白重組質(zhì)粒RP14的構(gòu)建，重組質(zhì)粒RP14經(jīng)質(zhì)粒PCR及再次雙酶切鑒定，挑取菌斑經(jīng)大腸桿菌E.Coli在普通LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)兩個階段后，轉(zhuǎn)化BL21菌株，轉(zhuǎn)入OvernightexpressTB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，10000 g離心后經(jīng)吹打沉淀，分離上清液及沉淀（包涵體），上清液和沉淀分別經(jīng)過SDSPAGE電泳分析，確定蛋白片段大小（-31 KDa， 含標(biāo)簽蛋白），發(fā)現(xiàn)該蛋白在上清液和包涵體中均有表達(dá)，但上清

3.1.2pat蛋白純化及免疫原的制備取上清液利用Merck公司HisBind蛋白親和純化試劑盒進(jìn)行過柱洗脫純化（圖2）。收集洗脫蛋白液進(jìn)行透析、凍干、二次溶解及超濾濃縮，利用BAC蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，冷凍干燥，

3.2單克隆抗體的制備

融合前4天對小鼠血清進(jìn)行效價與抑制率檢測。選取血清效價高（>8000）的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP 2/0 骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，[TS（][HT5”SS]圖3pat蛋白Western Blot免疫印跡分析（A：蛋白Marker； B， C和D：pat蛋白）

Fig.3Western Blot of pat protein （A： protein marker； BCD： pat protein）[HT5][TS）]融合率約為92% 。間接ELISA法檢測細(xì)胞上清液，選擇吸光值大于1.0的陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行多次克隆，篩選到一株效價與特異性均較好的單克隆細(xì)胞株，命名為2F6。將該細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，制備腹水并用飽和硫酸銨法純化抗體。冷凍干燥，

Symbolm@@ 40 ℃保存。用時取部分抗體用0.01 mol/L PBS稀釋成1 g/L備用。

3.3單克隆抗體的性質(zhì)鑒定

3.3.1單克隆抗體效價檢測間接ELISA法檢測抗pat蛋白單克隆抗體2F6的效價，以未免疫的小鼠血清作為陰性對照，測得抗pat蛋白單克隆抗體2F6的效價約為5×104。

3.3.2單克隆抗類型檢測利用Pierce公司的單抗類型檢測試劑盒對單抗2F6的類型進(jìn)行檢測（見表1）。結(jié)果表明：2F6與IgG1類和κ的吸光值分別是1.029和0.881，與其類型的IgG， IgA， IgM和λ幾乎沒有反應(yīng)。因此，抗pat蛋白單克隆抗體2F6為IgG1類，輕鏈為κ型。

交叉反應(yīng)率：ELISA法檢測抗pat蛋白單克隆抗體2F6的特異性，轉(zhuǎn)基因外源蛋白Bt Cry1Ac， Bt Cry2A， EPSPS和CpTI的抗原濃度為2 μg/mL時，其OD值和陰性對照相當(dāng)，表明抗pat蛋白單克隆抗體2F6與Bt Cry1Ac， Bt Cry2A， EPSPS和CpTI等外源蛋白不存在交叉反應(yīng)。

3.4多克隆抗體制備與純化

經(jīng)檢測兔血清效價>10000，將收集的兔血清用飽和硫酸銨法純化，冷凍干燥，

Symbolm@@ 40 ℃保存。用時取部分抗體用0.01 mol/L PBS稀釋成1 g/L備用。

3.5ELISA工作曲線

棋盤格驗(yàn)篩選最佳包被兔多克隆抗體、鼠單克隆抗體的工作濃度。確定pat蛋白雙抗夾心ELISA工作條件為：包被兔多克隆抗體1/2000，鼠單克隆抗體1/8000，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 1/1000。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4，線性回歸方程為y=0.6914x-2.572，相關(guān)系數(shù)R2=0.9951，檢測范圍為1.6-100 μg/L。

3.6轉(zhuǎn)基因棉中pat蛋白含量測定

中pat蛋白的含量，結(jié)果見表2。在5個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種中，只有3個檢測到pat蛋白； 而2個非轉(zhuǎn)基因棉花品種葉片中未檢出pat蛋白。2個抗蟲棉品種葉片中未檢出pat蛋白可能是由于該品種中未用pat標(biāo)記基因。

本研究通過質(zhì)粒構(gòu)建、基因克隆和原核表達(dá)，成功表達(dá)pat蛋白，利用所制備的抗pat蛋白的鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體，建立了可檢測pat蛋白的SandwichELISA方法。單抗效價為5×104；單抗為IgG1類，輕鏈為κ型；檢測范圍為1.56-100 μg/L。本研究所建立的SandwichELISA方法與文獻(xiàn)[13]中報道的直接包被pat標(biāo)準(zhǔn)蛋白或提取液，再加入抗pat兔多克隆抗體所建立的ELISA檢測方法相比具有更好的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性， 也避免了直接包被提取物易受樣品中油脂等干擾物影響的缺點(diǎn)。利用本研究所建立的ELISA方法測定了5個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和2個非轉(zhuǎn)基因棉花葉片中的pat含量，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中的3個品種檢測出pat蛋白，其余均未檢出pat蛋白。本研究所建立的檢測方法具有靈敏、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以用于檢測轉(zhuǎn)基因作物中的pat蛋白。

References

1Thompson C J， Movva N R， Tizard R， Crameri R， Davies J E， Lauwereys M， Botterman J. Embo J.， 1987， 6（9）： 2519-2523

2Wehrmann A， Van Vliet A， Opsomer C， Botterman J， Schulz A. Nat. Biotechnol.， 1996， 14（10）： 1274-1278

3Herouet C， Esdaile D J， Mallyon B A， Debruyne E， Schulz A， Currier T， Hendrickx K， van der Klis R， Rouan D. Regul. Toxicol. Pharm.， 2005， 41（2）： 134-149

4Ahmed F E. Trends Biotechnol.， 2002， 20（5）： 215-223

5Anklam E， Gadani F， Heinze P， Pijnenburg H， Van Den Eede G. Eur. Food Res. Technol.， 2002， 214（1）： 3-26

6Meyer R. Food Control， 1999， 10（6）： 391-399

7Zimmermann A， Hemmer W， Liniger M， Lüthy J， Pauli U. LWTFood Science and Technology， 1998， 31（7）： 664-667

8Tao Z， Cai X F， Yang S L， Gong Y. Plant Mol. Biol. Rep.， 2001， 19（4）： 289-298

9Studer E， Rhyner C， Lüthy J， Hübner P. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung undForschung A， 1998， 207（3）： 207-213

10Wurz A， Bluth A， Zeltz P， Pfeifer C， Willmund R. Food Control， 1999， 10（6）： 385-389

11Feriotto G， Borgatti M， Mischiati C， Bianchi N， Gambari R. J. Agr. Food Chem.， 2002， 50（5）： 955-962

12Lipp M， Anklam E， Stave J W. J. Aoac Int.， 2000， 83（4）： 919-927

13XU WenTao， HUANG KunLun， DENG AiKe， LUO YunBo. Chinese J. Agr. Biotechnol.， 2006， 3（3）： 177-182

許文濤， 黃昆侖， 鄧愛科， 羅云波. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2006， 3（3）： 177-182

14Zhao J， Li G， Wang B ， Liu W， Nan T ， Zhai Z， Li Z ， Li Q . Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 386（6）： 1735-1740

15NAN TieGui， HE SuPing， TAN GuiYu， LI Gang， WANG BaoMin， HUANG LuQi. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（8）： 1206-1210

南鐵貴， 何素平， 譚桂玉， 李 剛， 王保民， 黃璐琦. 分析化學(xué)， 2010， 38（8）： 1206-1210

16YANG YunYun， MOU DeHai， TONG ChaoYang， MU XiHui， HAO LanQun. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（3）： 439-442

楊運(yùn)云， 牟德海， 童朝陽， 穆唏惠， 郝蘭群. 分析化學(xué)， 2007， 35（3）： 439-442