血脂異常ApoE 基因缺失小鼠視網膜及Bruch 膜組織形態觀察

王 毅 馬玉蘭 巫 娟 曾慶華 李羅翔 李 娟

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是黃斑區光感受器、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）、Bruch 膜和脈絡膜毛細血管的慢性進行性變性，隨著年齡增長發病率增加，是發達國家導致不可逆視野缺損和失明的主要原因〔1〕。 世界衛生組織的研究報告表明，AMD致盲約占全球盲人的8.7%，全球約有3 000 萬AMD患者，每年約有50 萬人因AMD 致盲〔2〕。 在我國，由于人口老年化進程的加劇和飲食結構的變化， 其他致盲原因得到或加強了控制，AMD 日益成為重要致盲的眼病。 AMD 發病機理尚未明確，遺傳因素和環境因素的共同作用是AMD 主要的發病原因〔3〕，血脂異常作為重要危險因素之一，越來越受到研究者關注，遺傳學的研究證實AMD 的發生與載脂蛋白E（APOE）基因密切相關〔4〕。 ApoE-/-小鼠模型是研究動脈粥樣硬化和神經系統退行性疾病的常用模型，我們前期實驗通過觀察血脂異常ApoE-/-小鼠視網膜外核層厚度、色素上皮細胞層厚度及Bruch 膜改變，發現血脂異常ApoE-/-小鼠視網膜和Bruch 膜的病理改變與AMD 病理改變一致〔5〕，為更好闡明血脂異常ApoE-/-小鼠模型可作為研究AMD 動物模型，我們進一步觀察了血脂異常ApoE-/-小鼠模型視網膜外核層細胞、色素上皮細胞形態結構和細胞數目改變及Bruch 膜的組織形態改變，結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用2 月齡的雄性普食C57BL 小鼠和以C57BL 為背景的ApoE-/-小鼠，分別由四川大學華西實驗動物中心（動物合格證：川實動管質第09 號）和北京大學實驗動物中心（美國Jackson 實驗室引進）提供。普通飼料和高脂飼料均由成都達碩動物實驗有限公司提供。 所有實驗根據赫爾辛基宣言和保護及運用動物的指導原則來進行。

1.2 動物造模與分組

實驗分為3 組，將24 只ApoE-/-小鼠根據體重分層隨機分為：2 月齡ApoE-/-高脂組和2 月齡ApoE-/-普食組，每組12 只；另用12 只2 月齡C57BL普食組作為對照組。高脂組動物予高脂飼料，普食組動物予標準嚙齒類動物飼料，飼料與水均自由攝取，所有動物在裝有清潔過濾器的籠子中飼養，溫度保持在22℃～25℃，相對濕度50%，保持12 小時，晝夜循環，共喂養至4 月～6 月齡。

1.3 觀察指標及測試方法

1.3.1 血漿總膽固醇、低密度脂蛋白檢測：禁食8 小時后，在動物宰殺前靜脈注射鎮靜劑戊巴比妥鈉，用肝素化的采血管采集股靜脈血。使用日立7170 全自動生化分析儀檢測血漿總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）。

1.3.2 視網膜光感受器細胞和Bruch 膜組織形態觀察：摘出小鼠左眼，每組共12 只眼球，保留約1～2 mm 長視神經，用鋒利的刀片在角鞏緣處切一三角形小口，放入FAA（酒精-甲醛-醋酸）液中固定1周，切取含視神經的冠狀面眼球壁組織3～5 mm 厚，逐級酒精脫水、石蠟包埋，切片4 um，行Masson 三色染色。 Masson 染色結果為：細胞核呈紅色，光感受器細胞核呈鮮紅色，Bruch 膜呈藍綠色，纖維組織為綠色，脈絡膜呈特有的黑色。 光鏡下觀察染色切片，首先在低倍視野下（100×）觀察眼球壁各層組織結構，然后在中倍（200×）下觀察視網膜光感受器細胞和色素上皮層細胞的形態結構，選擇視盤兩端視網膜、脈絡膜各5 個視野，共計10 個視野，采用Mias2000 圖像分析系統（四川川大智勝軟件股份有限公司）半定量檢測視網膜光感受器細胞核的面積；每個視野光感受器細胞核面積，表示光感受器細胞數；上述10個視野色素上皮細胞核的數目， 表示色素上皮細胞數；另外每幅圖像10 次測量Bruch 膜厚度，取100次測量的平均值表示Bruch 膜厚度。 最后用高倍（400×）觀察Bruch 膜結構和有無玻璃膜疣形成。

1.3.3 色素上皮細胞和Bruch 膜的超微結構觀察：摘取小鼠右眼，每組取2 只眼球，經30ml/L 戊二醛預固定，10g/L 四氧化鋨再固定， 丙酮逐級脫水，Epon812 包埋，半薄切片光學顯微鏡下定位，超薄切片，醋酸鈾及枸酸鉛雙重染色，H-600Ⅳ型透射電鏡觀察。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行統計分析。 本研究實驗指標的數據資料以x±s 表示，3 個組小鼠血漿TC、LDL 濃度和光感受器細胞數、RPE 層細胞數及Bruch 膜厚度的差異均采用單因素方差分析，組間的多重比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠血漿TC、LDL 的比較

6 月齡ApoE-/-高脂組小鼠血漿TC、LDL 均顯著高于6 月齡ApoE-/-普食組和6 月齡C57BL 普食組 （P＜0.001），6 月齡ApoE-/-普食組小鼠血漿TC、LDL 顯著高于6 月齡C57BL 普食組（P＜0.001)（表1）。

表1 三組小鼠血漿TC、LDL 值（x±s，mmol/L）

2.2 三組小鼠視網膜光感受器細胞、RPE 及Bruch膜的組織形態改變

光鏡下觀察Masson 三色染色切片可見ApoE-/-高脂組小鼠視網膜變薄，光感受器細胞和RPE 細胞

均排列紊亂、稀疏和細胞萎縮，Bruch 膜變厚或粗細不均、膠原分叉，膜中聚集有大小、多少不等的紅色無結構物質，即玻璃膜疣（圖1-A）；ApoE-/-普食組小鼠視網膜較薄，光感受器細胞和RPE 排列較紊亂、稀疏，細胞萎縮程度輕，Bruch 膜變厚或粗細不均、膠原分叉，但未見明顯玻璃膜疣形成（圖1-B）；C57BL 普食組小鼠視網膜未見變薄，光感受器細胞和RPE 排列較整齊，未見明顯細胞萎縮、稀疏，Bruch膜無變厚或粗細不均、無膠原分叉，未見玻璃膜疣出現（圖1-C）。半定量檢測結果顯示光感受器細胞數：ApoE-/-高脂組比ApoE-/-普食組及C57BL 普食組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；RPE 數：ApoE-/-高脂組比C57BL 普食組明顯減少 （P＜0.001），比ApoE-/-普食組減少，差異無統計學意義（P＞0.05）；Bruch 膜厚度：ApoE-/-高脂組比ApoE-/-普食組及C57BL 普食組明顯增厚（P＜0.05，表2）。

2.3 視網膜RPE 和Bruch 膜超微結構改變

表2 三組小鼠光感受器細胞面積、RPE 數、Bruch 厚度值比較（x±s）

RPE：ApoE-/-高脂組色素上皮細胞基底膜皺褶變短且減少，胞質內線粒體腫脹，可見核邊聚，胞漿中可見大量空泡（圖2-A）；ApoE-/-普食組色素上皮細胞基底膜皺褶減少，胞質內線粒體輕度腫脹，可見核邊聚現象（圖2-B）；C57BL/6 普食組色素上皮細胞基底膜未見明顯皺褶，胞質內線粒體結構基本正常（圖2-C）。Bruch 膜：ApoE-/-高脂組Bruch 膜明顯增厚，纖維結構明顯減少，彈力層斷裂，出現大量空泡（圖2-A）。ApoE-/-普食組Bruch 膜纖維結構不均勻，彈力層斷裂，有空泡出現（圖2-B）。 C57BL/6普食組Bruch 膜纖維結構均勻，彈力層連續，未見明顯空泡（圖2-C）。

3 討論

病理學研究發現AMD 的發生與異常脂肪代謝及轉運相關〔6〕，Gaymer 研究證實高脂肪攝入與AMD發病風險增加有關〔7〕。 血脂異常可以導致視網膜色素上皮細胞的形態損害，Bruch 膜脂質的沉著破壞其完整性并導致脈絡膜毛細血管內皮細胞的病理改變〔8〕。Fritsche 等研究發現ApoE 基因多態性與AMD之間存在顯著相關性〔9〕，ApoE 是含有299 個氨基酸的磷脂糖蛋白，是組成脂蛋白的重要成分，其在調節脂質代謝、維持膽固醇平衡方面起重要作用。 ApoE基因及基因啟動子具有多態性，啟動子的突變顯著降低ApoE 基因的表達并進而影響ApoE 蛋白的功能〔10〕，致ApoE-/-小鼠出現高脂血癥〔11〕。

因此，我們采用高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠建立動物模型，結果發現，ApoE-/-普食組小鼠血漿總膽固醇和低密度脂蛋白比C57BL 普食組明顯增高（P＜0.001），高脂組ApoE-/-小鼠血漿總膽固醇和低密度脂蛋白比ApoE-/-小鼠普食組顯著增高（P＜0.001）。實驗結果顯示ApoE 基因缺失可引起脂質代謝障礙，導致小鼠高脂血癥，結果與Debernardi 等報道一致〔11〕，經高脂喂養后血脂更高，這也與我們前期的研究結果一致〔12〕。

AMD 分為干性和濕性兩種類型，干性AMD 以視網膜光感受器和RPE 改變為特征，表現為RPE及病變區的光感受器細胞萎縮，稱為地圖狀萎縮，玻璃膜疣形成，Bruch 膜增厚或粗細不等。 濕性AMD在具有干性AMD 病理改變基礎上，特征性的出現視網膜色素上皮下新生血管形成〔13，14〕。 我們通過高脂喂養ApoE-/-小鼠建立高脂血癥動物模型后觀察到，高脂組ApoE-/-小鼠視網膜光感受器細胞和色素上皮細胞排列紊亂、細胞萎縮，Bruch 膜變厚、粗細不等、膠原分叉，可見玻璃膜疣形成。 而作為對照組的C57BL 普食組小鼠視網膜光感受器細胞和色素上皮細胞、Bruch 膜均未見上述改變。 半定量檢測視網膜光感受器細胞、色素上皮細胞數，結果顯示高脂組ApoE-/-小鼠和普食組ApoE-/-小鼠視網膜光感受器細胞和色素上皮細胞數比普食組C57BL 小鼠明顯減少（P＜0.05-0.001），Bruch 膜厚度明顯增厚（P＜0.001）。超微結構觀察進一步顯示高脂組ApoE-/-小鼠RPE 和Bruch 膜出現明顯損傷，表現為：RPE基底膜皺褶變短且減少，胞質內線粒體腫脹，可見核邊聚，胞漿中可見大量空泡，Bruch 膜明顯增厚，纖維結構明顯減少，彈力層斷裂，出現大量空泡。 而作為對照組的普食組C57BL 小鼠視網膜RPE 基底膜未見明顯皺褶，胞質內線粒體結構基本正常，Bruch膜纖維結構均勻，彈力層連續，未見明顯空泡。 上述改變顯示高脂組ApoE-/-小鼠視網膜光感受器細胞、RPE 和Bruch 膜光鏡和電鏡下的組織形態改變符合AMD 的病理變化。

綜上所述，高脂血癥ApoE-/-小鼠視網膜光感受器細胞、色素上皮細胞及Bruch 膜發生了類似AMD的病理改變，可用該動物模型做AMD 的相關研究。

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